化脓性中耳炎病原谱分析及耐药性检测

刘瑞杰 王鑫霞 王露 赵梓尧 余驰昊 袁舒颖 陈妍雯 张绍兴 杨雪静 孙桂芹

化脓性中耳炎（suppurative otitis media，SOM）是一种临床常见的中耳疾病，儿童发病率较高［1-2］，可导致听力下降、耳痛以及流脓等临床症状［3-4］，若不能及时接受有效的治疗，会加重病情甚至可能威胁患者生命健康。引发SOM的主要因素是病原微生物感染［5-6］。随着抗生素的广泛使用，SOM患者分离到的病原菌对抗生素耐药性增强，给临床诊疗带来较大困扰［7-8］。目前，临床主要采用分离培养法检测SOM患者的病原菌，但该方法不能检出难培养和不可培养的微生物，而16S rDNA宏基因组技术能够对样本中微量、难培养的微生物进行检测［9］。该研究将16S rDNA宏基因组测序与分离培养相结合，对SOM患者耳道分泌物进行病原菌菌群结构、丰度分析，以提高SOM的诊断效率，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年3月至2019年9月在浙江中医药大学附属第一医院就诊的SOM患者耳道分泌物21例，另收集40例无耳道疾病健康大学生的耳道分泌物作为对照组。

1.2 仪器及试剂 仪器：生化培养箱（SPX-250B-Z，上海博迅实业有限公司）、生物安全柜（NU-425-400S，美国Nuaire公司）、全自动微生物鉴定仪（VITEK-2 COMPACT，法国生物梅里埃公司）及其配套的细菌鉴定卡（批号190213）等。试剂：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培养基（批号181212）、血琼脂培养基（批号190601），青霉素、头孢呋辛等药敏纸片（批号190523），均购自杭州滨和微生物试剂公司。

1.3 样本采集 参考《临床检验标本采集手册》（2011年）。由临床医护人员在额镜照明下，用75%乙醇清洁外耳道皮肤，再用经0.9%NaCl溶液湿润的无菌棉拭子在SOM患者患侧外耳道深部或鼓室内采集分泌物，置于无菌试管中。

1.4 细菌的分离培养及鉴定 将样本接种于血平板，37 ℃培养24 h~48 h，挑选单菌落制备0.50~0.63麦氏单位菌悬液，采用梅里埃VITEK-2全自动微生物鉴定仪及其配套试剂进行菌种鉴定。

1.5 16S rDNA宏基因组测序分析 利用16S rDNA宏基因组技术，对耳道分泌物中可培养、难培养的细菌进行检测。按照样本DNA提取、PCR扩增、测序、数据分析等步骤分析样本菌群，由杭州联川生物股份有限公司完成。

1.6 药物敏感试验 采用纸片扩散法，对SOM患者耳道分泌物分离的细菌进行药敏分析。将分离的病原菌制备成0.5麦氏单位菌悬液，均匀涂布于MH平板，将药敏纸片贴在平板上，37 ℃培养18 h~24 h，测量抑菌圈直径。结果判定参照美国临床实验室标准化委员会（2018）标准。

2 结果

2.1 SOM患者和健康人耳道分泌物分离培养结果 21例SOM患者耳道分泌物，10例培养出病原菌，检出率为47.6%，共分离得到病原菌16株，其中革兰阳性菌14株（87.5%），主要为金黄色葡萄球菌，革兰阴性菌1株（6.25%），真菌1株（6.25%）。40例健康人耳道分泌物分离得到77株菌，前3种为头葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌。SOM患者和健康人耳道微生物分布有较大差异。见表1。

表1 SOM患者和健康人耳道分泌物病原菌分布［n（%）］

2.2 16S rDNA宏基因组测序结果 21例SOM患者耳道分泌物（其中有4例样本未达到测序要求）和2例健康人耳道分泌物的16S rDNA宏基因组分析结果，见图1和表2。SOM002、SOM008、SOM010等9例样本分离培养与16S rDNA测序均检出为葡萄球菌；SOM009、SOM016等8例样本未培养出病原菌，而16S rDNA测序检出葡萄球菌和伯克霍尔德菌等。另外，SOM011、SOM019样本中检测到韦荣球菌、普雷沃菌等厌氧菌。16S rDNA测序与分离培养结果基本一致，但其微生物的种类和丰度存在一定差异。

图1 SOM患者（17例）和健康人（2例）耳道分泌物细菌丰度和物种分布图

表2 分离培养与16S rDNA测序结果比较

2.3 药物敏感性 SOM患者分离的金黄色葡萄球菌对头孢呋辛、头孢吡肟、苯唑西林等多种临床常用抗生素呈现较高的敏感率（＞75.0%），对青霉素的耐药率为100%，其中有1株金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药。SOM患者分离的耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌和健康人分离的头葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌对大多数抗菌药物敏感性较高，见表3和表4。

表3 SOM患者耳道分泌物主要革兰阳性菌的药物敏感性结果［n（%）］

表4 健康人耳道分泌物主要革兰阳性菌的药物敏感性结果［n（%）］

2.4 青霉素耐药株的β-内酰胺酶检测结果 SOM患者分离的葡萄球菌对青霉素耐药率较高，采用头孢硝噻吩纸片法检测耐药株产β-内酰胺酶情况，金黄色葡萄球菌青霉素耐药株的β-内酰胺酶阳性率为50.0%，里昂葡萄球菌、缓慢葡萄球菌均为阴性，见表5。

表5 头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶

3 讨论

病原菌感染是引发SOM的重要因素，可导致患者中耳黏膜化脓病变［10］。研究表明，不同地区SOM患者的病原菌类别及其耐药性存在差异［11］。熊素芳等［12］在508例SOM患者耳分泌物中分离到金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等病原菌。UDDÉN等［13］在184例SOM患者耳分泌物中分离到变形杆菌、铜绿假单胞菌及肠球菌等。由于抗生素在临床上的广泛应用，致使病原菌对抗生素的耐药性增加，给SOM治疗带来较大困扰［14］。

该研究通过分离培养方法分析SOM患者耳道分泌物的病原菌种类，其中革兰阳性菌检出率高于革兰阴性菌。SOM患者以金黄色葡萄球菌为主，健康人以头葡萄球菌为主，两组均分离到耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌，提示其为耳道正常定植菌，但在一定条件下可能成为致病菌。传统分离培养方法是经典方法，但对不易培养和不可培养的微生物难以检出，可通过16S rDNA宏基因组技术提高样本的检出效率［15］，该研究52.9%样本两种方法均检出葡萄球菌，与相关研究结果一致［9］。另外，部分样本培养结果为阴性，但是16S rDNA测序为阳性，考虑是因为苛氧菌或厌氧菌等不易培养的微生物、患者经过抗生素治疗或样本采集和送检过程中细菌死亡导致，因此可采用16S rDNA宏基因组技术弥补分离培养方法的缺陷，丰富SOM病原谱，或者通过调整难培养细菌的生长条件即培养基的营养物质，从而提高阳性检出率。16S rDNA宏基因组技术具有广泛的临床应用前景［16］，但易造成假阳性，检测过程中要严格避免杂菌污染。

该研究药敏试验结果显示，SOM患者分离的金黄色葡萄球菌对临床常用的头孢菌素类和氨基糖苷类药物的敏感率＞75.0%，对青霉素耐药率为100%，耐药菌株的β-内酰胺酶阳性率为50.0%，可能由其他耐药机制介导，如青霉素结合蛋白异构体（PBP2′）［17］。虽然金黄色葡萄球菌药物敏感率较高，未检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株，但检出1株万古霉素耐药，应关注其耐药性。

综上所述，临床应积极开展对SOM的病原菌检测及药敏分析，并依据实验数据合理用药，提高治疗效果，可减缓细菌耐药的发生。