还原响应性聚氨酯三嵌段共聚物的合成及应用

彭泽林， 谭佳佳， 张国颖

（中国科学技术大学高分子科学与工程系, 中科院软物质化学重点实验室, 合肥 230026）

近年来癌症发病率逐年上升，作为癌症治疗的主要手段之一，化疗在临床上广泛应用，而利用纳米载体输运化疗药物可以有效优化常规小分子药物的药代动力学和药效学行为，显示出更好的治疗效果，因此受到广泛关注。具有良好生物惰性和生物相容性的聚乙二醇 (PEG) 是药物载体设计中常用的聚合物，经与蛋白质、多肽、寡核苷酸、药物和脂类等共价偶联后，可以提高体系稳定性，延长体内循环寿命，优化药代动力学并降低全身毒性[1-3]。迄今为止，已有超过20种聚乙二醇化蛋白和多肽获得FDA和欧盟的批准上市。此外，基于PEG合成得到的两亲性嵌段共聚物也越来越多地通过自组装构筑纳米药物载体，以延长药物在体内血液中的循环时间，减少被网状内皮系统 (RES) 的吸收，并通过增强的渗透和滞留 (EPR) 效应在肿瘤中富集[4-7]。而在另一方面，如果能在药物载体达到肿瘤组织后实现药物的可控释放，则可进一步降低其对正常组织的毒性，增强治疗效果。

近20年来，刺激响应性聚合物在药物载体方面的应用研究取得了长足的进展[8-13]。其中，基于肿瘤微环境的特殊性而制备的刺激响应性聚合物纳米载体备受青睐。值得注意的是，作为肿瘤发展的生物标志性物质之一，谷胱甘肽 (GSH) 在血液和其他体液中的浓度仅为2～10 μmoL/L，而在胞浆中的浓度约为1～10 mmol/L。更重要的是，与正常组织和正常细胞相比，肿瘤组织和肿瘤细胞内GSH的浓度更高。因此，含二硫键结构的纳米药物载体有望在静脉注射后，在血液循环中保持其结构完整性并抑制治疗药物的释放，但在达到肿瘤组织被肿瘤细胞摄取后，在高浓度GSH等巯基化合物作用下可发生断键解离而实现药物的可控释放[14-17]。

另一方面，聚氨酯由于其结构和性能的可调控性及易于合成等优势在日常生活中广泛应用；生物相容性，尤其是生物可降解聚氨酯近年来逐渐引起人们的兴趣，在生物材料领域显示出极大的发展前景[18-22]，但在药物载体领域的研究相对较少。本文设计并合成了一类具有还原环境响应性的两亲性聚氨酯三嵌段共聚物-聚乙二醇-聚氨基甲酸酯-聚乙二醇 (PEG-PU(SS)-PEG)，由该共聚物在水溶液中自组装形成的胶束结构纳米粒子可作为药物载体在其疏水内核中负载疏水性药物。由于聚氨基甲酸酯PU(SS) 嵌段中二硫键结构的存在，这些纳米胶束在还原性微环境 (如GSH) 触发下可发生解离而释放所负载的药物 (图1)。

图 1 两亲性三嵌段共聚物PEG-PU(SS)-PEG的自组装及其还原响应性降解及药物释放过程示意图Fig. 1 Schematic illustrations for the self-assembly, redox-responsive disintegration and resulted drug release of the amphiphilic PEG-PU(SS)-PEG triblock copolymer

1 实验部分

1.1 主要原料

聚乙二醇单甲醚 (mPEG45-OH，Mn= 2.0×103，Mw/Mn= 1.06，聚合度DP = 45)、尼罗红 (NR)、GSH、姜黄素、双(2-羟乙基)二硫化物：阿拉丁试剂有限公司；2-硝基苄溴、咪唑、六甲基二异氰酸酯 (HDI)、对甲苯磺酸(TsOH)、碳酸钾 (K2CO3)、二月桂酸二丁基锡 (DBTL)、硫酸钠 (Na2SO4)、对甲苯磺酰氯 (TsCl)、甲苯、乙腈(MeCN)、二氯甲烷 (DCM)、甲醇、乙醇、石油醚 (PE)、四氢呋喃 (THF)、乙酸乙酯 (EA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜 (DMSO)、乙醚 (Et2O) ：国药试剂有限公司；无水THF、MeCN、DCM和甲苯从Pure-Solv 400溶剂处理系统中收集得到；用Milli-Q SP超纯水仪 (Millipore) 对水进行去离子化，其比电阻率为18.4 MΩ·cm；其他试剂均购自国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与表征

核磁共振 (NMR) 谱图使用Bruker AVANCE III NMR 400 MHz核磁共振波谱仪测试得到，以四甲基硅烷(TMS) 为内标，以氘代二甲亚砜 (DMSO-d6) 为溶剂；聚合物的分子量和分子量分布采用配备有Water 1515泵和Water 2414 微分折射率检测器 (温度设置为35 ℃) 的凝胶渗透色谱仪 (GPC) 测定，该仪器以串联的方式使用两根Styragel色谱柱 (HR2和HR4)，柱温箱温度为35 ℃，并以一系列窄分布的聚乙烯 (PS) 为标样，以THF为洗脱液，流速设定为1.0 mL/min；采用动态光散射仪(DLS) 测定组装体的流体动力学直径和尺寸分布，在ALV/DLS/SLS-5022 F上进行，光源为圆柱形22 mW UNIPHASE He-Ne激光器 (632 nm)，收集173°散射光；采用Hitachi H-80 透射电子显微镜 (TEM) 观察组装体形貌；荧光光谱采用Horiba荧光分光光度计测试得到。

1.3 PEG-PU(SS)-PEG的合成

PEG-PU(SS)-PEG的合成路线如图2所示。氮气氛围下，将双(2-羟乙基)二硫化物 (212.3 mg, 1.38 mmol)溶于无水THF中，然后加入HDI (243.9 mg, 1.45 mmol) 和 DBTL (50 μL)，将溶液加热至40 ℃，搅拌反应5 h后，再加入mPEG45-OH (420 mg, 0.21 mmol)，继续搅拌反应24 h。反应结束后将反应混合物在Et2O-DCM (体积比4∶1，下文同)混合液中进行沉淀，过滤收集沉淀后再在THF中溶解，然后再用Et2O-DCM混合液进行沉淀，上述溶解-沉淀重复3次后，将得到的沉淀在真空干燥箱中干燥24 h，得到淡黄色固体状产物，即PEG-PU(SS)-PEG，产率81%。

图 2 PEG-PU(SS)-PEG三嵌段共聚物的合成路线Fig. 2 Synthetic route of PEG-PU(SS)-PEG triblock copolymer

1.4 PEG-PU(SS)-PEG的自组装

PEG-PU(SS)-PEG纳米胶束的制备：采用纳米闪沉法使PEG-PU(SS)-PEG聚合物进行自组装制备纳米胶束。首先称取10 mg PEG-PU(SS)-PEG溶于0.5 mL THF中，然后在剧烈的磁力搅拌下将溶液快速注射入9.5 mL去离子水中，再将其转移到截留分子量 (MWCO) 为3×103的透析袋中，置于去离子水中透析6 h除去THF。

负载NR的纳米胶束的制备：将NR和PEG-PU(SS)-PEG共同溶解于1 mL THF中，最终质量浓度分别为0.1 g/L和10 g/L，然后在剧烈的磁力搅拌下将溶液快速注射入9 mL去离子水中，再将其转移到透析袋 (MWCO =3×103) 中，用去离子水中透析6 h。

负载姜黄素的纳米胶束的制备：首先称取10 mg PEG-PU(SS)-PEG和4 mg 姜黄素共同溶于1 mL THF中，然后在剧烈的磁力搅拌下将溶液快速注射入9 mL去离子水中，再将其转移到透析袋 (MWCO = 3×103)中，置于去离子水中透析6 h。根据由不同浓度的姜黄素溶液 (DMSO-H2O混合溶剂，体积比 9∶1) 测试得到的荧光光谱所绘制的标准曲线计算相应的载药量和载药效率。

1.5 胶束的还原响应性解离过程跟踪

通过GPC跟踪检测PEG-PU(SS)-PEG胶束在GSH触发下由于聚合物的降解所发生的解离过程。具体操作如下：磁力搅拌 (600 r/min) 下，在50 mL PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液 (1.0 g/L) 中加入50 mg GSH(3.25 mmol/L)，在不同时刻取等量样品，经氮气吹扫除去溶剂后再溶解于THF中，溶液经220 nm有机滤膜过滤后进行GPC测试。

通过DLS跟踪检测PEG-PU(SS)-PEG胶束的还原响应性解离过程。具体操作如下：磁力搅拌 (600 r/min)下，在10 mL PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液 (1.0 g/L) 中加入10 mg的GSH (3.25 mmol/L)，在不同时刻透过450 nm滤膜分别进行DLS测试，收集173°散射光，每次测试持续5 min，连续测试3次取平均值，使用累积量分析和CONTIN程序计算组装体的流体动力学直径和尺寸分布。

通过荧光光谱仪跟踪检测负载有NR的PEG-PU(SS)-PEG胶束的还原响应性解离过程。具体操作如下：在50 mL负载有NR的PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液 (1.0 g/L) 中加入50 mg GSH (3.25 mmol/L)，在不同时刻分别进行荧光测试，激发波长设置为540 nm，发射波长设置为560～750 nm。

1.6 胶束中姜黄素的释放

将负载有姜黄素的PEG-PU(SS)-PEG胶束分散在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS） (pH=7.4，10 mmol/L) 中配制成30 mL质量浓度为1.0 g/L的分散液，在其中加入30 mg GSH (3.25 mmol/L) 再等体积分为6等份，分别在37 ℃下放置不同时间后，各取100 μL转移至微量透析管 (MWCO = 2×103) 中，在37 ℃下浸泡在PBS 缓冲液中透析6 h。然后收集透析管外的PBS 缓冲液冻干，将得到的样品溶解于DMSO-H2O (体积比9∶1)混合溶剂中测试其荧光光谱，根据前述测试得到的标准曲线计算姜黄素在不同时刻的累积释放量。

2 结果与讨论

2.1 PEG-PU(SS)-PEG共聚物的表征

PEG-PU(SS)-PEG的化学结构和链结构采用1H-NMR进行表征，结果如图3(a)所示。谱图中各信号峰的归属如下：δ(i)=7.18 (-NH-)，δ(a)=3.24 (-OCH3)，δ(b)=3.51 (-OCH2CH2O-)，δ(c)=4.41 (-CH2OCONH-)，δ(d)=2.95 (-CH2CH2NHCOO-)，δ(e)=1.37 (-CH2CH2NHCOO-)，δ(f)=1.22 (-NH(CH2)2CH2(CH2)2NH-)，δ(g)=4.18 (-SCH2CH2OCO-)，δ(h)=2.95 (-SCH2CH2OCO-)，δ(DMSO)=2.50。根据1H-NMR的表征结果，以链末端甲基H原子数目为基准，由积分可计算出氨基H原子数目为24，因此PEG-PU(SS)-PEG分子链中聚氨基甲酸酯嵌段的重复单元数为11，数均分子量为8 053.63。GPC表征结果表明，其数均分子量Mn=8.20×103，与1H-NMR结果相一致；Mw=1.16×104，分散指数PDI=1.42 (图3(b))。

图 3 PEG-PU(SS)-PEG三嵌段共聚物的 (a) 1H-NMR谱图和 (b) GPC曲线Fig. 3 (a) 1H-NMR spectrum and (b) GPC curve of PEG-PU(SS)-PEG triblock copolymer

2.2 PEG-PU(SS)-PEG的自组装及组装体形貌

分子链中同时具有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物在水溶液中可以经自组装形成不同形貌的超分子组装体。PEG-PU(SS)-PEG经闪沉法制备得到的组装体形貌如图4（a，b）所示，为明显的球状胶束粒子，平均粒径在100 nm左右 (图4(a))，因此有利于通过EPR效应在肿瘤组织富集。

图 4 PEG-PU(SS)-PEG组装体在 (a) 经GSH处理前和 (b) 加入GSH处理8 h后的TEM照片Fig. 4 TEM images obtained for PEG-PU(SS)-PEG self-assemblies (a) without GSH and (b) after being treated with GSH for 8 h

2.3 PEG-PU(SS)-PEG及其组装体的还原环境响应性

首先，从分子水平上验证PEG-PU(SS)-PEG的还原响应性，采用GPC跟踪测量PEG-PU(SS)-PEG的分子量在加入GSH处理后的变化。如图5所示，在组装体分散液中加入GSH处理1 h后，PEGPU(SS)-PEG嵌段共聚物洗脱峰即发生明显右移，随处理时间延长逐渐向低分子量范围移动；在经GSH处理6 h后，聚合物已基本完全降解，GPC曲线上17 min左右的洗脱峰对应于亲水段PEG，共聚物分子链中的疏水段已降解成小分子物质 (图1)。这些结果表明，由于疏水性PU(SS) 嵌段中二硫键结构的存在，使PEG-PU(SS)-PEG具有还原环境响应性，在GSH等巯基化合物作用下可以通过二硫键的断裂触发降解。

图 5 mPEG45-OH和PEG-PU(SS)-PEG经GSH处理不同时间后的GPC曲线Fig. 5 GPC traces recorded for mPEG45-OH and PEG-PU(SS)-PEG after being treated with GSH for different time

图 6 (a) PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液的归一化散射光强(I/I0)和＜Dh＞随GSH处理时间的变化；(b) PEG-PU(SS)-PEG胶束在加入GSH前和经GSH处理6 h后的＜Dh＞分布Fig. 6 (a) Evolution of the normalized scattering intensity (I/I0) and ＜Dh＞, recorded for PEG-PU(SS)-PEG micellar dispersion in the presence of GSH; (b) The hydrodynamic diameter distributions of PEG-PU(SS)-PEG micellar dispersions before and after 6 h of incubation with GSH

为了进一步探究PEG-PU(SS)-PEG的还原环境响应性，采用DLS跟踪监测了由PEG-PU(SS)-PEG组装形成的纳米胶束分散液的散射光强和胶束尺寸在加入GSH处理不同时刻的变化，结果如图6所示。在加入GSH之前，PEG-PU(SS)-PEG胶束的流体力学直径(＜Dh＞)约为120 nm。考虑到DLS是在溶液状态下进行测试，此结果与图4(a) 中组装体粒径的TEM表征结果 (约100 nm) 基本一致。而在组装体分散液中加入GSH之后，体系的散射光强随处理时间的延长而逐渐下降，组装体的＜Dh＞也逐渐减小，在6 h后基本达到平衡，＜Dh＞ 减小至25 nm。这表明还原响应性的PEG-PU(SS)-PEG共聚物在经GSH触发下发生降解后，可导致胶束逐渐发生解离。此外，胶束在GSH作用下的解离由TEM观察结果也可以得到证明，由图4(b) 可见，在PEG-PU(SS)-PEG组装体分散液中加入GSH处理8 h后，在TEM照片中已基本上观察不到胶束粒子的存在。

疏水性的荧光探针尼罗红对环境极性极其敏感，在弱极性疏水环境中可以发出强烈荧光，而在极性较强的亲水环境中的荧光强度则很弱。因此通过疏水相互作用将NR负载于胶束组装体的疏水性内核中，利用其荧光发射性质的变化可以检测PEG-PU(SS)-PEG纳米胶束的响应性解离过程。如图7所示，在540 nm的激发光照射下，负载有NR的PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液在560～750 nm显示出强烈的荧光发射，表明NR被负载于PEG-PU(SS)-PEG胶束内核而处于极性较弱的疏水性环境中。然而，当体系中加入GSH后，随着时间的延长，胶束分散液体系的荧光发射强度逐渐下降，表明NR分子所处的微环境由疏水性逐渐转变为亲水性，这显然是由于PEG-PU(SS)-PEG胶束组装体在GSH作用下发生了解离，使NR从组装体中被释放出来进入极性水分散液中，从而导致其荧光发射强度减弱。

图 7 负载有NR的PEG-PU(SS)-PEG组装体分散液在加入GSH后 (a) 荧光光谱随时间的变化以及 (b)在614 nm处的归一化荧光强度随时间的变化Fig. 7 (a) Evolution of the fluorescence emission spectra and (b) evolution of the normalized fluorescence intensity at 614 nm recorded for NR-loaded PEG-PU(SS)-PEG micellar dispersions upon addition of GSH

2.4 姜黄素的负载及响应性释放

综上所述，疏水性聚氨基甲酸酯嵌段中二硫键结构的存在，赋予了PEG-PU(SS)-PEG两亲性三嵌段共聚物对还原性环境的响应性，由其自组装形成的胶束粒子在GSH的存在下可因共聚物链中二硫键的断裂而发生解离，因此有望将PEG-PU(SS)-PEG组装体用作药物载体，在富含GSH 的肿瘤组织和肿瘤细胞内实现负载药物的响应性释放。而在另一方面，姜黄素是从姜黄中提取出来的一种天然多酚药物，在抗炎、抗癌、抗菌和抗氧化等方面具有良好的应用前景，但因水溶解性差、生物利用率低而使其实际应用受到限制，将其负载于纳米载体中则可改善以上缺陷[23]。因此，本文通过纳米闪沉法制备得到在疏水内核中负载有姜黄素的PEGPU(SS)-PEG胶束组装体，进一步研究了以PEG-PU(SS)-PEG胶束作为药物载体的可行性。

姜黄素溶液荧光光谱见图8(a)，选取530 nm处的荧光强度对溶液浓度进行线性拟合得到标准曲线图8(b)。然后取负载姜黄素的PEG-PU(SS)-PEG胶束分散液冻干后称重，再将其溶解于DMSO-H2O (体积比9∶1) 中制成500 mL的稀释溶液进行荧光光谱测试 (图8(c))，测得530 nm处的荧光强度后根据标准曲线计算样品中姜黄素的含量，由此可计算得到胶束中姜黄素的载药量为22.2%，载药效率为71.3%，表明PEG-PU(SS)-PEG胶束对姜黄素的负载效果良好，这可能是因为姜黄素的分子结构中含有羟基 (图1)，可以和PEG-PU(SS)-PEG聚合物分子链中的氨基甲酸酯结构之间形成较强的氢键相互作用[24-26]，从而提高对姜黄素的负载量。

为了模拟生理环境下药物的释放，在含有GSH的PBS 缓冲液 (pH=7.4) 中进行了载药胶束的药物释放实验，并设置空白对照组，根据上述建立的标准曲线计算药物在不同时刻的累积释放量，结果如图8(d)所示。在体系中加入GSH之后，随着PEG-PU(SS)-PEG的降解和胶束结构的解离，负载于胶束中的姜黄素被释放，在6 h后基本达到平衡，累计释放量约为90%；而在不加GSH的情况下，在相同时间内并无明显的药物释放，这表明胶束载药体系的结构稳定性较高，在GSH浓度较低的人体血液和细胞外液中能够稳定存在，从而可以减少药物的提前释放，避免暴释，降低药物的全身毒性；而在纳米载药体系经EPR效应进入肿瘤组织、被肿瘤细胞摄取后，可在高浓度GSH等巯基化合物的触发下发生解离，释放所负载的化疗药物，达到治疗效果。

图 8 姜黄素溶液的(a)荧光光谱和(b)荧光强度-浓度标准曲线；负载姜黄素的PEG-PU(SS)-PEG组装体的(c)荧光发射光谱和(d)在有GSH或无GSH存在情况下的药物释放曲线Fig. 8 (a) Fluorescence emission spectra and (b) fluorescence intensity-concentration standard calibration curves of curcumin solution;(c) Fluorescence emission spectrum and (d) release profile of curcumin from curcumin-loaded PEG-PU(SS)-PEG nanocarriers in the absence and presence of GSH, respectively

3 结 论

(1) 采用逐步聚合法合成了一类具有还原环境响应性的两亲性聚氨酯三嵌段聚合物-聚乙二醇-聚氨基甲酸酯-聚乙二醇。

(2) PEG-PU(SS)-PEG在水溶液中组装形成的纳米胶束可在其疏水内核中负载疏水性化疗药物姜黄素，制备得到纳米载药体系。

(3) 由于共聚物分子链上PU(SS) 中间嵌段的还原环境响应性，PEG-PU(SS)-PEG在GSH触发下可发生降解，从而导致胶束结构的解离并释放所负载的姜黄素。

(4) 通过改变刺激响应性基元的结构，以此类两亲性三嵌段共聚物为平台，有望构筑得到多种具有不同刺激响应性的纳米载药体系。