骨关节炎软骨代谢相关生物标志物的研究进展

陈宗锐，孙洁，姜萍

(山东中医药大学，济南 250014)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的慢性退行性疾病之一，以关节软骨进行性降解、软骨下骨增厚和骨赘形成为特征，并最终导致关节活动度和关节功能丧失[1]。全世界约有2.5亿人患有膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)，其发病率在50岁以上人群中随年龄增长而显著增加，且女性发病率高于男性[2]。在全球范围内，OA已成为重要的致残原因，居全球致残原因的第11位[2-3]。OA的危险因素大致可分为个人因素(年龄、性别、肥胖、遗传等)和关节因素(关节损伤和关节负荷异常等)，其发病机制目前尚未明确，但可以确定的是关节软骨代谢在OA发病、进展过程中起重要作用。软骨是一种无血管、神经及淋巴组织分布的结缔组织，由软骨细胞(articular cartilage，AC)和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成，软骨代谢主要涉及AC产生纤维(由胶原蛋白和弹性蛋白组成)、蛋白聚糖(主要为聚集蛋白聚糖)和非胶原糖蛋白以构成ECM以及AC合成的蛋白酶、生长因子参与维持ECM的稳态两大过程[4]。随着分子生物学的发展，探寻并研究更为敏感且特异的OA生物标志物逐渐受到国内外学者的关注，而在患者体液(血液、尿液和关节液等)中含有许多软骨代谢产物，这为发现并研究新的OA生物标志物奠定了基础，也为OA早期确诊、诊后分期及病情预后的研究提供了理论依据。现就OA软骨代谢相关生物标志物予以综述，以期为OA软骨代谢的机制研究与探索新的生物标志物提供参考。

1 ECM代谢相关生物标志物

ECM是关节软骨的重要组成成分，其分解代谢增加是OA发生和发展的关键因素。Ⅱ型胶原是软骨中最丰富的蛋白，Ⅱ型胶原C端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collagen，CTX-Ⅱ)、Ⅱ型胶原C端裂解新表位(collagen type-Ⅱ C-terminal cleavage neoepitope，C2C)、Ⅱ型胶原螺旋肽(type Ⅱ collagen helical peptide，HELIX-Ⅱ)、肽Coll2-1(peptide Coll2-1，Coll2-1)等均能反映其降解水平，其他ECM衍生的标志物[如软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)-846]则分别反映了非胶原糖蛋白和蛋白聚糖的降解水平，这些标志物参与了ECM的代谢，性质稳定且易于检出，是有助于识别OA及监测疾病进展的潜在工具。

1.1CTX-Ⅱ 胶原纤维主要由Ⅱ型胶原(占90%以上)构成，而CTX-Ⅱ是Ⅱ型胶原1/4长片段的降解产物。既往研究表明，尿液中CTX-Ⅱ水平可能反映了OA 患者Ⅱ型胶原降解的程度[5]。Liu等[6]对34例KOA患者尿液中的CTX-Ⅱ进行分析发现，临床KOA患者K-L分级(Kellgren- Lawrence分级)与尿液的CTX-Ⅱ浓度呈正相关，而在KOA进展过程中CTX-Ⅱ的水平显著升高。一项针对KOA患者和健康对照者尿液CTX-Ⅱ研究的荟萃分析显示，KOA患者尿液CTX-Ⅱ水平显著升高，尤以重度KOA和女性KOA患者为著[7]。这些均表明，尿液CTX-Ⅱ水平对KOA具有一定的诊断意义，且其或许能够反映KOA的疾病严重程度。另一项荟萃分析显示，尿液 CTX-Ⅱ只在K-L分级达到3级及以上时具有显著的统计学意义，表明尿液CTX-Ⅱ在KOA的早期阶段表达不明显，其在尿液中的出现及水平升高可能是症状加重的标志[8]。Bai和Li[9]对成年兔OA病理过程的不同阶段进行研究发现，各时间点OA组的Mankin评分及血清CTX-Ⅱ水平均显著升高，表明血清CTX-Ⅱ水平随着时间延长及OA病情进展而升高，故检测血清CTX-Ⅱ水平对早期诊断OA和评价疾病的严重程度均有意义。但另有研究认为，与血清CTX-Ⅱ水平相比，尿液CTX-Ⅱ水平对OA的诊断和评估敏感性更高[10]。又因为尿液检测属于无创检测，且CTX-Ⅱ具有良好的稳定性，故以尿液CTX-Ⅱ水平进行OA的诊断和病情评估更加简便有效，但对于症状不明显的早期KOA患者仍需检测其血清水平及联合其他检查以明确诊断。

1.2C2C C2C是Ⅱ型胶原C端3/4长片段的裂解产物，以小肽形式存在于血液、尿液及关节液中，可反映关节软骨的降解水平。Conrozier等[11]对髋关节OA患者进行研究发现，C2C和关节间隙狭窄有显著关系，在评估累及单个关节的软骨降解患者中具有价值。He等[12]的研究显示，KOA患者尿液中的C2C水平明显增高，且C2C水平随着KOA病情逐渐进展而增加。陆军帅等[13]的研究结果显示，尿液C2C水平与KOA患者膝关节K-L分级呈正相关。C2C与OA患者影像学进展关系密切，且尤以尿液样本更为敏感，故检测尿液C2C对于评价OA患者影像学改变严重程度具有重要意义，可能成为评价OA患者病情进展程度的一种标志物。

1.3HELIX-Ⅱ HELIX-Ⅱ是软骨胶原通过组织蛋白酶降解产生的Ⅱ型胶原裂解片段，可用于反映软骨降解情况和OA的病情。Kalaï等[14]对Ⅱ型胶原裂解物与KOA的相关性进行研究，结果表明HELIX-Ⅱ在2年内的纵向变化与关节间隙狭窄呈显著正相关。Wei等[15]通过研究83例接受膝关节镜或膝关节置换术患者的软骨损伤程度，发现关节液HELIX-Ⅱ水平与软骨损伤累积评分和最大评分呈显著正相关，且HELIX-Ⅱ水平升高与早期软骨病变相关。这表明，HELIX-Ⅱ在关节软骨降解过程中具有重要意义，或许是OA软骨损伤过程的重要环节，其水平在一定程度上反映了病情的严重程度，对于早期软骨破坏和早期OA的判断具有重要价值。Garnero等[16]研究显示，尿液HELIX-Ⅱ水平升高与快速破坏性髋关节OA相关，HELIX-Ⅱ单独或与CTX-Ⅱ联合检测可用于髋关节OA患者的临床研究。这一研究表明，HELIX-Ⅱ水平在髋关节OA的诊断中具有一定价值，可成为判断髋关节OA严重程度的有效标志物，也为两种或多种标志物联合检测以判断OA病情的进展提供了参考。

1.4Coll2-1 Coll2-1及其硝化形式(Coll2-1NO2)来源于Ⅱ型胶原的三螺旋结构，被认为是OA软骨降解的潜在标志物[17]。Henrotin等[18]通过前瞻性研究发现，Coll2-1、Coll2-1NO2及Coll2-1NO2/Coll2-1比值与反映Ⅱ型胶原损伤的标志物Ⅱ型前胶原 C端前肽存在显著相关性，表明其可能参与关节软骨的降解。另有研究显示，Coll2-1和Coll2-1NO2具有双重意义，不仅能反映软骨降解，还反映了OA的重要特征炎症和氧化应激[19]。Deberg等[20]研究表明，Coll2-1是一种OA病情的特异性标志物，对单个关节发生的结构变化较为敏感。Rasha等[21]的研究同样验证了Coll2-1水平在单侧膝关节OA患者中的相关性，并发现其水平在K-L分级≥3级的中晚期KOA患者中较K-L分级<3级的早期KOA患者显著升高。Hick等[22]对121例KOA患者Coll2-1及Coll2-1NO2水平与磁共振成像之间的关系进行研究发现，血清Coll2-1及Coll2-1NO2水平与滑膜炎、骨磨损及关节下囊肿等均呈显著正相关，且疼痛恶化者的基线Coll2-1NO2水平高于未进展者。这表明，Coll2-1及Coll2-1NO2与影像学OA的严重程度存在一致性，对于OA病情严重程度及预后的判断均具有价值。Coll2-1与Coll2-1NO2是反映OA软骨分解代谢的特异性标志物，且可能参与炎症的产生，其有望成为KOA诊断的一种新型生物标志物，但仍需进一步研究。

1.5CS-846 蛋白聚糖是由核心蛋白与1个以上的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)通过共价键形式构成的一种复合糖，GAG约占蛋白聚糖分子量的90%，其由6个亚单位组成，包括CS-4和CS-6、硫酸角质素、透明质酸、硫酸皮肤素和硫酸肝烷。CS-846属于GAG亚族，能够促进软骨的再生与修复。Ma等[23]对大鼠的研究表明，术后10周模型组大鼠的血清CS-846水平较对照组显著升高，且CS-846 水平与国际骨关节炎研究学会评分呈正相关。表明CS-846作为一种保护性因素，其血清浓度可反映软骨生成代谢的水平，能一定程度体现OA软骨损伤后的再生和修复能力，间接反映了OA关节损伤的严重程度，故可作为诊断和监测OA进展的生物标志物。张军锋等[24]对50例KOA患者进行研究，结果表明血清CS-846水平与疼痛视觉模拟评分法评分及关节间隙狭窄程度呈正相关。Dou等[25]对100例接受膝关节置换术的KOA患者进行研究发现，与健康对照组者相比，KOA患者血清CS-846水平升高，且其水平与视觉模拟评分法评分和关节间隙狭窄也呈正相关；此外他们进行受试者工作特征曲线分析发现，miR-33-3p、COMP和CS-846的联合检测对KOA患者具有较高的诊断价值。这些均表明，CS-846在KOA的早期诊断中具有较高的价值，同时若与其他生物标志物联合应用可作为诊断KOA和评估病情严重程度的新的生物标志物。

1.6COMP COMP是一种大的五聚体糖蛋白，为软骨非胶原糖蛋白的主要组成成分，属于血小板反应蛋白家族，在软骨内高表达，有较强的组织特异性。一项研究证明，K-L分级0级或1级的早期OA患者血清COMP水平显著高于非OA患者，且血清COMP是发现早期OA的独立因素，并进一步提出其最佳临界值为152 ng/ml[26]。这一研究为早期OA的诊断提供了有效而具体的证据，表明COMP是诊断OA尤其是早期OA的重要标志物。Akinmade等[27]通过研究COMP水平与临床分级(Lequesne指数)和放射学分级(K-L分级)的相关性发现，KOA患者的COMP水平显著高于非疾病患者，且随KOA严重程度的增加而升高，表明COMP不仅可用于OA的诊断，也是评估OA病情严重程度的一种标志物。Fernandes等[28]对272例KOA患者的血清COMP水平进行研究发现，有临床症状的KOA患者的血清COMP水平显著高于健康人群和无症状的关节间隙狭窄患者，且有KOA临床症状而无放射学异常(K-L分级0级或1级)的患者血清COMP水平显著高于健康人群，表明血清COMP水平与OA患者临床症状严重程度相关，且对于无明显放射学异常的临床症状显著的KOA患者软骨损伤具有预测价值。Lynch等[29]对髋关节OA患者的生物标志物进行分析，认为COMP是OA的特异性标志物，对OA的诊断和管理具有潜在的实用性。COMP是当前OA生物标志物研究中的热点，其对OA的诊断、病情程度的评估及病情进展的预测均具有一定价值，较广泛地用于OA药物干预或治疗后的评估，是OA一种潜在重要的生物标志物。

2 AC合成与分泌相关生物标志物

AC是软骨中唯一的细胞种类，仅占软骨组织体积的一小部分，但由于其负责分泌合成ECM的构成成分及软骨代谢相关蛋白酶、生长因子、炎症因子等以维持软骨的完整性，所以AC的破坏及其分泌异常均可能破坏软骨内稳态并导致OA产生，而AC生成的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)与白细胞介素(interleukin，IL)等可诱导炎症发生和软骨降解，并反过来导致AC的衰老、破坏，形成恶性循环，进而导致OA的发生和发展。

2.1MMP MMP是一种依赖Ca2+、Zn2+的蛋白酶，主要降解胶原纤维与蛋白聚糖，以维持ECM的稳态。MMP由24个不同的MMP基因和23个不同的MMP蛋白组成，根据其结构域组织、序列相似性及其底物的特异性可分为四类，其中与软骨损伤相关的有MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13等。Bo等[30]在研究发育性髋关节发育不良并发OA大鼠模型中，应用免疫组织化学和实时荧光定量聚合酶链反应均检测到MMP-13的表达增加，表明MMP-13可能是OA早发的一个重要因素。Wilkinson等[31]研究认为，MMP-13与OA的病情进展相关，是OA软骨破坏发生的关键控制点。Ding等[32]研究发现，OA成骨细胞与AC共培养可促进MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白及基因的高表达。Li等[33]对105例KOA患者外周血MMP的研究显示，早期KOA(Ⅰ级)患者血浆MMP-3、MMP-9水平以及MMP-9信使RNA的转录水平均显著升高，且表达水平与临床症状严重程度(Lequesne指数)呈正相关，表明MMP-3、MMP-9水平和MMP-9 信使RNA的转录水平在影像学特征不明显时，可能对早期KOA诊断具有较高的敏感性，且也是判断KOA临床症状严重程度较为客观的标志物。MMP是近年来OA研究的热点，其在基因与蛋白水平的表达与OA炎症产生和软骨降解均有一定相关性，但特异性不高，可能是预测OA病情进展程度的一种潜在生物标志物，有待更多探索。

2.2ADAMTS ADAMTS家族由19种分泌型锌金属蛋白酶组成，并具有几个不同的模块，包括前结构域、金属蛋白酶结构域、解整合素样结构域和血小板反应蛋白1型基序，均参与ECM的降解过程。Wang等[34]研究显示，ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-5基因和蛋白的表达水平在OA的关节软骨、软骨下骨和生长板中均有升高，表明其参与了OA的软骨破坏及骨侵蚀，提示OA病情的进展。Sharma等[35]研究发现，ADAMTS-5介导的软骨降解中激活了Toll样受体，从而导致分解代谢酶与炎症因子的激活，进而导致关节破坏与疼痛，这为更好地理解ADAMTS-5致炎致损的病理机制起了积极作用，也表明ADAMTS-5活性是判断OA关节损伤和临床症状严重程度的有效标志。胡光亮等[36]对100例OA患者相关生物标志物进行研究发现，滑膜中ADAMTS-7蛋白、ADAMTS-7信使RNA的表达水平与OA的病变严重度呈正相关，表明ADAMTS-7水平的高低对于判断OA病情严重程度具有重要意义，可作为判断OA病情程度及预后的一种潜在标志物。

2.3IL IL是与OA发病及病情进展相关的一类炎症介质，其表达与软骨的降解损伤和滑膜炎症密切关联。Ruan等[37]在一项针对160例KOA患者的横断面研究中发现，血清IL-8水平与膝关节症状增加、髌下脂肪垫磁共振成像信号强度改变及血清骨和(或)软骨生物标志物水平呈正相关，表明IL-8可能在KOA中发挥作用。Udomsinprasert等[38]对IL-34在关节炎中的作用进行分析，发现负责软骨降解的促炎性细胞因子参与调节IL-34表达，而在KOA患者的血清和滑液中IL-34水平显著升高；同时，他们还发现其水平与影像学严重程度呈正相关。Snelling等[39]研究显示，关节液中测得IL-17的患者骨赘、硬化及最小关节间隙宽度明显减小，提示关节液中的IL-17可能对具有不同生物学和临床特征的大量原发性终末期 OA患者亚群的识别具有意义。另有研究证明，IL-1和IL-6作为较为明确的OA生物标志物，可促进ECM的降解和AC的破坏，引起滑膜炎症反应，进而加重OA的病情程度[40]。以上研究表明，OA的发病及进展均有IL的参与，其中IL-1、IL-6和IL-8参与了OA的软骨破坏和炎症过程，其水平的高低反映了OA的炎症水平，是判断病情严重程度的生物标志物，而IL-17和IL-34多反映晚期OA的关节骨损害，对于判断病情预后具有较大的价值。

3 结 语

目前，OA的临床诊断和对病情预后的评估大多依靠X线、磁共振成像或关节镜检查，而X线对于早期OA的诊断不敏感，磁共振成像检查的费用较为昂贵，关节镜检查属于有创性操作，它们对于OA的诊断和预测均有其局限性，故探寻更为敏感、特异、无创或微创而又检测费用低廉的诊断手段尤为重要。生物标志物可以弥补以上检查手段的不足，具有独特优势，可能成为诊断和评估OA的有效方法。迄今为止，大量生物标志物研究仍未发现可推广应用于早期临床诊断、分期及预后的生物标志物，这或许受OA病因、发病机制复杂的影响；此外，目前生物标志物的研究多停留在细胞或分子水平，对于上游信号因子和信号通路亟须探索和完善。软骨的损伤及修复贯穿OA发病的全过程，故从软骨代谢的角度探索新的更为敏感及特异的生物标志物，将多种生物标志物联合应用，将对OA的早期诊断、分期和监测更具意义。