非生物胁迫调控甜菊糖苷合成的研究进展

徐新娟，冯玉丹，吴静，罗庆云

（1.河南科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡 453003；2.南京农业大学园艺学院，南京 210095）

0 引言

复杂多变的自然环境中存在各种限制植物生长发育的非生物胁迫因子，如干旱、盐渍、高低温、土壤重金属污染等等，严重影响植物的地理分布、限制作物产量并威胁生产安全，越来越多极端天气的出现更加剧非生物胁迫对农业生产的影响[1-2]。植物响应非生物胁迫产生的一系列反应能够及时、高效地应对环境变化[3]，通过激活抗氧化系统以尽量避免严重的氧化伤害，具体表现为体内抗氧化酶活性增强、渗透调节物质数量增多以及抗逆基因的转录调控等[4]。如何感受和响应非生物胁迫是一个根本性的生物学问题，植物必须及时预测环境变化并做出积极有效的响应[5]。提高植物抵抗非生物胁迫能力对农业生产和环境可持续性具有极其重要的意义。

甜叶菊（Stevia rebaudianaBert.）又名甜菊、甜草、甜茶，是双子叶植物纲、菊科、甜叶菊属的多年生药用草本植物，也是世界第三大天然糖源植物，其叶片富含的甜菊糖苷（Steviol glycosides,SGs）具有高甜度（蔗糖的250～450 倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）、易溶解、性质稳定（耐酸碱及高温）且不被人体吸收等特点，适应于糖尿病、肥胖症及小儿龋齿等患者，作为代糖品广泛应用于医药、食品、饮料和保健品等行业，具有非常好的发展前景[6]。甜菊糖苷是一类由苷类组成的混合物，主要成分有甜菊苷（Stevioside,STV）、瑞鲍迪苷系列（Rebaudioside A、B、C、D、E 等）和杜尔可苷系列（Dulcoside），化学结构均为四环二萜类化合物，属于植物次生代谢产物的范畴[7]。研究表明，次生代谢与植物抗性及品质密切相关[8]，植物通过提高次生代谢产物提高自身保护和生存竞争能力，环境胁迫显著刺激植物次生代谢产物的积累[9]。如非生物胁迫诱导剂—过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激反应能够促进甜叶菊SGs 的大量积累[10]，纳米粒子作为植物非生物胁迫诱导因子也对甜菊糖苷的积累发挥着重要作用，当培养基中氧化锌纳米粒子浓度为1 mg/L时，RA和STV含量达到最大值[11-12]，这表明甜菊糖苷参与植物抗逆的环境应答过程。

我国拥有世界最大的甜叶菊种植面积，也是全球最大的甜菊糖苷生产国和出口国，出口量占全球80%以上。随着甜菊糖苷市场需求的不断增加，甜叶菊种植面积也逐年扩大，在江苏、江西、甘肃、黑龙江、新疆、内蒙等地均有大面积种植。笔者在国内实地调查中发现，不同产区的环境差异使得甜叶菊承受各种各样的非生物胁迫，长期种植实践中的弊端如栽培技术不规范、化肥农药过度投入、水肥管理不科学及长期连作等进一步加剧胁迫的伤害程度，这些都严重影响甜菊糖苷的合成与积累，制约该产业的可持续发展。因此，本文参考国内外近十年来相关文献，总结非生物胁迫如何影响甜菊糖苷的合成积累，并结合自身研究结果提出可行性建议，以期为生产上甜叶菊的良种选育及高效优质栽培提供理论参考。

1 水分胁迫

甜叶菊最早起源于南美洲的半湿润区域，根浅、喜湿怕旱，水分胁迫一直是世界范围内甜叶菊生产中的主要胁迫因子，尤其是在以我国西北为主的干旱及半干旱地区。

1.1 干旱胁迫

水分亏缺造成的干旱导致大量活性氧自由基产生，严重损伤蛋白质、质膜、叶绿素等细胞组分，对植物生长、光合作用及产量品质均产生不利影响[13]。已有研究中，轻度干旱胁迫（70%土壤相对含水量）可显著增加决明子（Cassia obtusifoliaL.）指标性成分蒽醌类化合物的含量和产量[14]。干旱显著抑制甜叶菊生长并降低干叶产量[15-16]，也显著影响甜叶菊叶片糖苷含量[17]。以聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫的试验结果表明，5%～15%PEG 处理后甜叶菊叶片中STV、RA、RB、RC 及总苷含量显著下降；干旱处理抑制糖苷相关核心基因的转录，与糖苷合成有关的内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、内根-贝壳杉烯酸羟化酶以及3 个依赖UDP 的糖基转移酶（UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1）的转录水平均显著下降[18]，这意味着有利于糖苷增加的干旱胁迫浓度可能低于5%PEG。温室实验结果表明，在土壤含水量接近60%田间持水量条件下甜叶菊生长良好且SGs 含量较高，RA/STV 比值也达到最大值[19]。这表明甜叶菊对轻度水分胁迫具有一定的耐受性，在生产上可指导缺水地区的适度灌溉。但除了受干旱胁迫程度影响外，甜菊糖苷对干旱胁迫的响应还受不同环境和实验因素的影响，干旱调控糖苷合成的分子机制仍需进一步研究。

植物在水分胁迫发生后迅速启动自身防御系统，干旱胁迫下甜叶菊叶片总氨基酸含量和总糖含量显著增加[15]；叶片细胞保护酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等活性随胁迫程度加剧表现出先升高后降低的变化趋势，重度干旱胁迫下（土壤含水量为田间最大持水量的20%）脯氨酸含量急剧升高[20]。组培实验结果表明，在培养基中加入外源NO 供体硝普钠（SNP）或者腐胺（Putrescine）均能显著减轻干旱胁迫带来的负面影响，二者联合作用效果更加突出[21]。作为赤霉素生物合成抑制剂的三唑类化合物（Triazole）可以降低植株高度、叶面积及生物量[22]。2 mg/L 多效唑（Paclobutrazol）能够部分恢复干旱胁迫下甜叶菊植株的重量，降低干旱胁迫对细胞脂质过氧化的负作用，减轻细胞电解质渗漏并降低丙二醛（MDA）含量，同时显著增加甜菜碱、维生素E、脯氨酸和蛋白质的含量[23]。此外，多效唑显著缓解干旱胁迫下总甜菊糖苷含量的下降，这与多效唑增加甜菊叶中可溶糖产量和总抗氧化能力密切相关[24]。以上表明植物生长延缓剂（PGRs）通过诱导不同的耐受机制在调节植物对非生物胁迫的反应中发挥着重要作用。

1.2 涝害

水分过多造成地下组织氧气供应不足，抑制根系呼吸从而影响植株地上部生长。涝害在甜叶菊生产中并不常见，但由于甜叶菊的生长周期为4—10 月份，江苏、安徽等一些种植地区的季节性涝害会对甜叶菊生长发育产生影响。盆栽试验结果表明，短期涝害对甜叶菊影响不大，但随着涝害时间持续，叶绿素含量、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）及单株干叶产量均显著下降，胞间CO2浓度（Ci）呈上升趋势[25]。这是由于根系受淹后，气孔阻力加大或关闭进而气孔导度下降，随后导致Pn和Tr下降而Ci升高。目前关于涝害对甜菊糖苷的影响及甜叶菊减轻涝害的生理机制还不清楚。

2 温度胁迫

温度胁迫包括高温胁迫和低温胁迫，由高温造成的伤害称为热害，典型的热害症状为水渍状烫伤斑点，甜叶菊在44 ℃高温时会产生明显的热害症状[26]。冷害（零上低温）直接抑制代谢酶或者基因表达重组而影响植物的新陈代谢和基因表达[27]。冷害较轻时菊花通过增加可溶性糖含量等渗调物质及提高抗氧化酶活性来减轻胁迫伤害；当冷害持续并转变为冻害（零下低温）时，植株体内的抗氧化酶活性显著下降，MDA 含量显著升高，光合能力也显著降低[28]。甜叶菊原产于亚热带地区，属于喜温作物，但亦能耐一定的低温，气温在20～30 ℃时最适宜生长。与25 ℃正常生长温度相比，4 ℃低温和44 ℃高温显著增加甜叶菊叶片中STV 含量，且STV 含量随胁迫时间延长而增加；高温还显著促进RA与RC积累，低温则起相反作用[26]。这表明轻微温度逆境有利于甜菊糖苷的合成，但不同温度胁迫对糖苷组分的影响存在差异。

3 盐碱胁迫

近年来，我国甜叶菊种植面积逐渐向西北干旱及半干旱地区发展，该区域主要采用覆膜滴灌方式，基本满足作物对水分的需求，但由于气候干旱、蒸发强烈，容易产生土壤盐渍化，导致土壤板结、肥力下降，土壤中高浓度盐分（主要是Na+）导致离子毒性、高渗胁迫以及氧化损伤等次级胁迫，影响养分有效性、运输和分布从而使植物营养失衡，如施肥不当更易加重盐碱胁迫的伤害。

3.1 盐碱胁迫对甜叶菊生长及甜菊糖苷生产的影响

甜叶菊对盐分较为敏感[29-30]，在含盐量0.6%的土壤中生长45 d 后甜叶菊植株全部死亡[31]。不同品种甜叶菊抵御盐胁迫的能力也不同[32-34]，并且碱性盐的抑制作用要高于中性盐，因为碱胁迫在盐胁迫的基础上增加了高pH 胁迫[35]。基质培养结果表明，碱胁迫（Na2CO3）下耐碱品种叶片SOD 和POD 活性显著高于敏感品种[36]。因此，甜叶菊不同品种对盐分浓度有一个特定的阈值，在此阈值范围内可通过调节自身保护酶系统维持正常代谢平衡，如增加大气CO2浓度可显著抑制NaCl 胁迫对光合速率的抑制[37]。研究还发现，盐胁迫（90～120 mmol/L NaCl）引起甜叶菊细胞钙离子（Ca2+）水平的改变，进而转导盐胁迫信号，启动基因表达和胞内一系列生化过程来适应环境变化[38]。代谢物分析鉴定结果显示，盐胁迫下甜叶菊代谢产物表型发生了改变，氨基酸和胺类成为主要的渗调物质[39]，这与丹参通过增加渗透调节物质来缓解高盐毒害相一致[40]。STV和RA 结构中分别含有3 个和4 个葡萄糖分子，它们在盐胁迫时的积累可能与甜叶菊的渗透调节过程有关，这是因为盐胁迫激活抗逆系统，使植物细胞由初生代谢转向次生代谢。离体培养条件下，盐胁迫和碱胁迫对甜叶菊幼苗糖苷含量的影响不同，0.1%NaCl 和0.025%Na2CO3处理下甜叶菊叶片SGs含量（STV+RA）分别是对照的1.6 倍和3.3 倍[41]；温室试验中，30 mmol/L NaCl 的低盐处理下RA 和STV 含量达到最高[42]；90、120 mmol/L NaCl 处理显著降低RA 和STV 含量，但却增加了RA/STV 的比值[43]。CANTABELLA 等[44]研究也表明，NaCl 处理25 d 后，甜叶菊幼苗SGs和RA 含量基本保持不变，STV 含量在2 g/L NaCl（约等于34 mmol/L）和5 g/L NaCl（约等于86 mmol/L）处理下分别增加了25%和降低了15%。基因水平检测结果进一步证实，NaCl 处理后，几个编码糖苷生物合成途径的关键酶基因（CMS、CMK、HDR、UGT76G1）显著上调[45]，盐度还可通过提高UGT76G1基因的转录调节STV 向RA 的转化[43]。综上，甜叶菊对盐胁迫有一定的耐受性，属于中度耐盐植物，低盐环境可能更有利于甜菊糖苷组分的优化，这对控制RA 和STV 的相对含量具有重要意义，也为甜菊糖苷的积累提供了新的理论途径。

3.2 外源物质在甜菊糖苷抗盐胁迫中的应用

3.2.1 营养物质

植物抵抗胁迫的能力与其营养水平有着密切关系[46]，外源施用矿质元素对胁迫具有一定的缓解作用[47]。叶面喷施营养液通过改善盐胁迫下植株的根系特征和水分状况帮助植物耐受过量的Na水平，如叶面喷施微量元素硼（B）、铁（Fe）以及有益元素硒（Se）能够显著促进甜叶菊植株生长、提高叶片糖苷含量，并减轻NaCl胁迫对研究性状的不利影响[48-49]。因此，研究不同元素的耐盐机制对指导盐碱地区施肥具有积极的应用价值。最新研究表明，被誉为天然植物促长剂的壳聚糖能够诱导植物的化学防御活性，增强防御酶活性及次生代谢产物形成；在甜叶菊上的应用结果显示，壳聚糖可以促进盐胁迫下STV 和RA 的积累，通过增加盐适应因子减少NaCl胁迫并提高甜菊糖苷的耐盐能力[50]。

3.2.2 植物生长调节剂

植物生长调节剂调控作物生长发育的各个方面，同时增强作物抗逆性，如氯化氯代胆碱（矮壮素，一种季铵盐类植物生长调节剂）能够响应甜叶菊病原菌胁迫[51]。水杨酸（SA）是一种酚类物质，在植物免疫反应中起至关重要的作用[52]，也参与植物对非生物胁迫的响应，外源施用SA 显著改善盐胁迫下拟南芥种子的萌发[53]。VAZQUEZ-HERNANDEZ等[54]研究发现0.1 mmol/L SA 显著促进温室条件下甜叶菊生长、提高SGs含量并增加SrKA13H、SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1等与甜菊糖苷生物合成相关基因的表达，这与EL-HOUSINI[55]之前的研究结果相一致。表明SA 可能通过诱导广泛的与植物抗性相关过程缓解盐胁迫伤害，其中促进SGs积累或许是主要方式。

3.2.3 有益微生物

近年来，植物与微生物的关系备受关注，与根系相关的有益微生物可以促进植物生长，并有可能提高作物对未来干旱的抵抗力[56]。已有研究报道，根际益生菌如解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）能够产生挥发性化合物以拮抗植物土传病原真菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense）[57]，解淀粉芽孢杆菌还可以通过分泌亚精胺增强植物的抗盐胁迫能力[58]。笔者在新疆库尔勒地区的实验结果显示，土壤盐碱化抑制甜叶菊生长，施用含有芽孢和木霉的生物有机肥能够显著缓解这种抑制作用，尤其是在长期连作甜叶菊的地块，与对照相比，施用生物有机肥后发病率和病情指数显著降低，相对防治效果则显著升高[59]。因此，通过植物有益促生菌改善土壤微生物群落来调控甜叶菊的抗盐碱胁迫能力以及甜菊糖苷的合成积累是切实可行的，但植物与微生物对胁迫反应的复杂反馈机制仍需深入探讨。

4 重金属胁迫

重金属是限制作物产量的一个重要因子，尤其是在干旱及半干旱地区。镉（Cd）在土壤中具有较强的化学活性，极易被植物吸收并存留在植物经济器官从而危害人体健康[60]，是目前危害性最为严重的重金属之一。研究发现，超过3 mg/L Cd 即显著抑制波斯菊种子萌发与幼苗生长，随着Cd质量浓度增加，幼苗的可溶性蛋白含量、MDA 含量、POD 活性和SOD 活性也发生显著变化[61]。Cd 胁迫通过降低植物内源激素水平抑制植物生长，外加激素能够缓解这种抑制作用[62]。组培试验结果表明，甜叶菊叶片的茎长、叶数、叶长等形态性状随培养基中Cd 浓度的增加而显著下降，外源施用多胺（Polyamine,PA）则逆转Cd的诱导效应[63]，这表明多胺代谢途径变化可以响应重金属胁迫过程。另外，矿质元素在一定条件下也能够缓解重金属胁迫[52]，如外源钼（Mo）降低Cd 胁迫对油菜的毒害[64]，Se、硫（S）和硅（Si）缓解Cd 对水稻的胁迫[65-68]，以上表明可以从营养水平开展矿质元素及植物有益元素对重金属胁迫下甜菊糖苷积累的研究。尽管重金属胁迫影响植株生长，但对甜菊糖苷的积累却有积极的作用，MIRZAEI 等[69]研究发现三氧化铬（CrO3）、氧化铅（PbO）、二氧化钛（TiO2）等金属氧化物导致参与STV 和RA 生物合成调控基因表达的增加。因此，如何协调重金属抑制生长与促进糖苷积累二者之间的关系尤为重要。

5 展望

逆境胁迫对植物次生代谢产物的影响是显而易见的。就甜叶菊而言，非生物胁迫一方面通过抑制植物的初生代谢过程抑制植物自身生长甚至引起不可逆的伤害；另一方面又可以激发植物体内各种防御系统，产生大量次生代谢产物来抵御外界不良因子，这对于提高甜菊糖苷含量具有很好的指导意义。鉴于植物自身存在多种环境反应或调控机制，利用非生物胁迫诱导甜菊糖苷积累仍需更加全面深入地研究。

5.1 加强甜菊糖苷耐非生物胁迫的分子机制研究

次生代谢产物在提高植物自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系上起着重要作用，长期的恶劣气候条件可能导致甜叶菊基因构成产生不同程度的变异，如干旱处理抑制糖苷合成相关的大部分基因转录[70]，但适度胁迫能够激发植物的次生代谢途径，可在一定程度提高药用植物活性成分含量[71]。目前大多研究主要集中在基础生理生化机制上，较少涉及其耐胁迫的遗传机理和分子调控机制。今后应借助快速发展的分子生物学、生物信息学、代谢组学及转录组学等多学科手段，加速明确甜菊糖苷耐各种胁迫的分子途径，最大限度挖掘甜叶菊自身的生物学潜力，通过鉴定与关键性状和信号转导途径相关的基因，探索一条抗逆性、产量及品质安全调控的新途径，为育种或工程改造来改善甜叶菊及抗逆高效栽培提供依据，这对甜叶菊的可持续发展具有非常重要的理论和实践意义。

5.2 加强甜菊糖苷对共胁迫的响应机制研究

不同胁迫引起植物在代谢和生理性状、基因表达上产生特异反应，当两种或几种胁迫共存时，不同胁迫因子组合能够产生加强、重叠或者拮抗效应[72]，冷害、热害、高盐导致的渗透胁迫以及氧化胁迫、重金属和激素处理都会导致植物细胞质自由钙离子浓度增加，进而引发一系列生理生化反应。如低温和高光强有利于银杏叶中黄酮类化合物的积累，而高温和高光强则有利于银杏叶中萜内酯含量的积累[73]。植物通过调节其次生代谢产物分配、权衡不同次生化学反应来适应复杂的环境变化，通过选择性的调整、优先对胁迫较大的因子做出响应。目前我国甜叶菊种植区域分布较广，各地环境存在较大差异，主要胁迫表现形式也不同，如江苏地区甜叶菊生长主要面临夏季高温及雨水导致的涝害，新疆地区主要面临夏季的高温胁迫和干旱胁迫以及长期连作导致的土壤营养胁迫等，未来研究应关注甜菊糖苷如何同步响应多个非生物胁迫，加强对胁迫信号的选择性以及调整机制的研究。

5.3 加强非生物胁迫与甜菊糖苷积累的全生育期研究

已有非生物胁迫方面的研究大多集中于基质培养、盆栽试验及苗期处理，很少涉及大田生产及生育后期，后期需开展田间试验以量化具体的参数设置。甜叶菊在不同生育时期对胁迫的抵御能力和防御机制不同，不同生育期胁迫对产量、品质的影响也不同，尤其是在抗性品种选育中，鉴定品种的抗性应以关键时期的抗性表现为主[74]，不能只局限于苗期或个别生育时期的特征。对于药用植物而言，形成其主要活性成分的次生代谢产物含量变化具有明显的生育时期效应，如甜菊糖苷在现蕾期含量达到最大（干重的10%以上），如何优化调控各个生育时期的生长以获取最大产量的糖苷显得尤为重要。因此，今后应结合产量及品质因素加强全生育期研究，系统探索甜菊糖苷对不同非生物胁迫的适应机制。