长链非编码RNA 相关的竞争性内源性RNA 网络中结肠腺癌潜在生物标志物的研究进展

童曼曼，刘熙称，孙晓宇，何行

吉林大学第一医院急诊科，长春 130021

近年来，非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）是恶性肿瘤研究领域的热点，ncRNA没有编码蛋白质的能力，主要包括核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）、转运RNA（transfer RNA，tRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。它们的共同特征是从基因组转录而来，但是却不能翻译成蛋白质，仅能在RNA水平上发挥其生物学功能。研究证实，ncRNA在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用，尤其是miRNA和lncRNA，其多样性及复杂的作用机制与恶性肿瘤密切相关[1]。miRNA是内源性小分子RNA，通过与靶mRNA结合来调节蛋白质的表达。lncRNA具有200多个核苷酸，广泛分布于基因组中，是潜在的肿瘤治疗靶标和生物标志物。2011年Salmena等[2]首次提出了竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）假说，该假说提出了一种新型的大规模调节性RNA网络，该网络通过转录组中的miRNA反应元件在mRNA和ncRNA之间相互影响。随后几年，该假说得到了许多后续实验证据的不断支持。在ceRNA网络中，lncRNA的作用是通过影响miRNA参与细胞生物学调控，从而在肿瘤发生发展中起到关键作用。结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）是结肠癌的一种亚型，是全世界恶性肿瘤相关死亡原因的第一名，结肠癌的发病率和病死率均逐年增加，尽早发现结肠癌尤为重要，尽管肠镜检查是结肠癌早期诊断的最可靠方法，但有创性和不适感限制了其广泛使用[3]。因此，寻找早期诊断COAD的准确且无创的生物标志物意义重大。COAD的预后评估有助于优化治疗方案的选择，因此，寻找新的生物标志物，并研究COAD发生发展的分子机制具有重要意义。本文对COAD中充当ceRNA的lncRNA进行综述，以期能够探索COAD遗传层面的分子机制和开发新的生物标志物及治疗靶标，为COAD的治疗和药物设计提供新的线索。

1 早期COAD 的潜在生物标志物

Liu等[4]研究纳入3例早期COAD患者和3例结肠上皮内瘤变患者，并构建DEmiRNADElncRNA-DEmRNA共表达网络，通过RNA测序获得了5个具有早期潜在诊断价值的差异表达的lncRNA（differentiallyexpressedlncRNA，DElncRNA）：ELFN1反义 RNA1（ELFN1 antisense RNA 1，ELFN1-AS1）、长基因间非蛋白编码RNA 1234（long intergenic non-protein coding RNA 1234，LINC01234）、小核RNA宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）、尿路上皮癌相关蛋 白 1（urothelial cancer associated 1，UCA1）和LOC101929549。该研究发现，miRNA-153-3p-SNHG17-Ⅺ型胶原蛋白α1链（collagen typeⅪalpha 1 chain，COL11A1）/胰岛素样生长因子结合蛋白3（insulin like growth factorbinding protein 3，IGFBP3）/KLF 转录因子 6（KLF transcription factor 6，KLF6）相互作用在早期COAD中起重要作用。

miRNA-153能够通过诱导基质金属蛋白酶9（与结肠癌转移相关的效应物）的产生间接促进结肠癌细胞侵袭，在DElncRNA-DEmiRNA共表达网络中，SNHG17与miRNA-153-3p在早期COAD中共表达。COL11A1编码Ⅺ型胶原（一种次要纤维状胶原）的两个α链之一，前胶原11A1是COL11A1的主要产物，COAD基质细胞中COL11A1表达上调，而前胶原11A1的表达上调与淋巴结受累和COAD远处转移有关[5]。IGFBP3是胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin like growth factor binding protein，IGFBP）家族成员，该家族可调节胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）的表达并与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用，IGFBP3缺失后可通过抑制p53依赖性细胞凋亡促进COAD的发展。KLF6是一种锌指转录因子，其表达缺失是结肠癌中的常见事件和早期事件，可通过上调细胞周期抑制剂p21的表达抑制肿瘤细胞增殖。

除SNHG17外，早期COAD中的3个DElncRNA（ELFN1-AS1、UCA1和LINC01234）也与COL11A1、IGFBP3和KLF6共表达，通过调节这些结肠癌相关基因的表达参与早期COAD的进展[4]。ELFN1-AS1是与KLF6和N-乙酰半乳糖胺基转移酶（N-acetylgalactosaminyl transferase，GALNT）8共 表 达 的DElncRNA，更值得关注的是其可作为早期COAD中DElncRNA-DEmRNA共表达网络和DEmiRNADElncRNA-DEmRNA相互作用网络的中枢lncRNA。GALNT引起的糖基化异常是人类恶性肿瘤中发生的病理现象，GALNT8作为GALNT成员，在早期COAD中表达下调[6]。

UCA1可通过促进肿瘤细胞增殖在结直肠癌的发生发展中发挥关键作用，结直肠癌中可观察到UCA1表达上调，提示其对结直肠癌具有潜在的诊断价值。UCA1表达水平还与大肠癌患者的肿瘤大小、浸润深度和预后密切相关。此外，UCA1和LINC01234还是早期COAD中最先上调的两个DElncRNA。而LINC01234和SNHG17则是DEmiRNA-DElncRNA-DEmRNA相互作用网络中的两个中枢lncRNA。LOC101929549通过顺式调节GALNT8和KLF6的表达在COAD中发挥重要作用。

2 COAD 预后的潜在生物标志物

Zhang等[7]从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中提取关键数据，分析生物学过程中COAD特异性mRNA的表达，通过构建COAD特异性mRNA、miRNA和lncRNA的ceRNA网络，进一步分析涉及lncRNA的COAD表达模式与临床特征之间的相关性，最终证实了3种与某些临床特征相关的lncRNA[长基因间非蛋白编码 RNA 335（long intergenic non-protein coding RNA 355，LINC00355）、肝细胞癌上调的长链非编码RNA（hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA，HULC）和IGF2反义RNA（IGF2 antisense RNA，IGF2-AS）]，确定了4种与总生存期（overall survival，OS）呈负相关的lncRNA[HOX 转录反义 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、LINC00355、KCNQ1反义链/反义转录 1（KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1，KCNQ1OT1）和TSSC1内含子转录本1（TSSC1 intronic transcript 1，TSSC1-IT1）]，并且这4种lncRNA主要集中在丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）途径中。通过对lncRNA与直肠癌关键临床特征进行分析，结果发现，LINC00355与肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移有关，HULC与肿瘤分期和淋巴结转移有关，而IGF2-AS与远处转移有关。

HULC能够与zeste2多梳抑制复合物2亚基增强子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）相互作用，通过表观遗传调控抑制结直肠癌细胞中裸角质层2（naked cuticle 2，NKD2）的表达，从而促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭并诱导肿瘤细胞凋亡。NKD2是裸角质层（naked cuticle，NKD）家族成员之一，经常被甲基化，并通过充当WNT信号的负调节剂，抑制肿瘤生长和转移。HULC在结直肠癌中过表达，其水平升高与预后不良和生存期缩短有关，而敲除HULC会在体外促进肿瘤细胞凋亡，并在体内抑制结直肠癌细胞的致瘤性。

LINC00355不仅有助于ceRNA网络的调控，而且在结直肠癌多个病理阶段中其表达均表现出显著变化，LINC00355被认为是有希望的结直肠癌治疗靶标[8]。IGF2-AS是针对IGF2的反义lncRNA，并已被证实可促进丙型肝炎病毒的复制。IGF2的过表达是结直肠癌发生的公认危险因素之一，其是肿瘤分期的标志物，也是结直肠癌发生的关键因素[9]。 与 癌 胚 抗 原（carcino embryonic antigen，CEA）和糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）的组合相比，某些形式的RNA（如lncRNA 91H、PVT-1和MEG3）诊断早期结直肠癌的灵敏度更高，可用于结直肠癌的早期诊断[10]。

Wang等[11]全面分析了COAD中蛋白质编码和非编码RNA的测序数据，所构建的COAD特异性ceRNA网络突出强调了KCNQ1OT1-hsa-miRNA-183-程序性死亡受体 4（programmed cell death 4，PDCD4）、KCNQ1OT1-hsa-miRNA-424-原肌球蛋白2β（tropomyosin 2 beta，TPM2）、HOTAIR-hsa-miRNA-143-纤溶酶原激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor 1，SERPINE1）之间的相互作用。KCNQ1OT1是KCNQ1基因的反义分子，其在结直肠癌中的转录频率很高，并且通过与β-联蛋白（βcatenin）结合促进KCNQ1OT1启动。miRNA-183通过降解ATP结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）促进结肠癌细胞增殖并抑制其凋亡，还可以通过结合其3'非翻译区（untranslated region，UTR）调节早期生长反应因子1（early growth response factor 1，EGR1）和磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表达，miRNA-183-EGR1-PTEN失调是结肠癌发生的关键。此外，miRNA-21还可通过靶向PDCD4促进结直肠癌细胞转移。KCNQ1OT1过表达可促进miRNA-183表达，从而导致PDCD4表达下调，这可能是COAD发展的重要机制。

TPM2在结肠癌中通常被异常的DNA甲基化沉默，其下调与结肠癌中RhoA激活和肿瘤细胞增殖相关。HOTAIR是一种经过充分研究的lncRNA，已被广泛报道是多种恶性肿瘤的致癌分子，通过上调结直肠腺癌中miRNA-93的表达和下调自噬相关蛋白12（autophagy related 12，ATG12）的表达，降低细胞活力，促进细胞凋亡并抑制细胞自噬，与结直肠癌转移和预后不良显著相关。此外，HOTAIR敲除还可通过调节miRNA-93/ATG12通路增强放疗敏感性，是放疗抗性的关键调节剂和潜在的生物标志物[12]。

SERPINE1基因在大肠癌和高度增殖的结肠癌细胞系中表达增加，并且与肿瘤的侵袭性有关。miRNA-143可以调节结直肠腺癌细胞增殖和凋亡，miRNA-143被lncRNA HOTAIR上调并靶向lncRNA HOTAIR，而SERPINE1被miRNA-143上调并靶向miRNA-143，证明HOTAIR-miRNA-143-SERPINE1相互作用可能是COAD发展的另一重要机制。Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子26（encoding Rho guanine nucleotide exchange factor 26，ARHGEF26）-AS1是编码ARHGEF26的反义RNA，可以影响白细胞的跨内皮迁移，重要的是ARHGEF26-AS1可以被miRNA-143下调，提示ARHGEF26-AS1和相关网络可能在COAD中发挥重要作用[11]。

3 COAD 复发的潜在生物标志物

Chen等[13]通过建立用于预测COAD复发的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，鉴定出5种用于预测COAD复发的生物标志物[癌易感性候选基 因 2（cancer susceptibility candidate 2，CASC2）、AL078459.1、AL390066.1、STK4 反义 RNA1（STK4 antisense RNA1，STK4-AS1）和HOXA簇反义RNA3（HOXAcluster antisense RNA3，HOXA-AS3）]。

CASC2是在多种恶性肿瘤中下调的lncRNA，其表达降低与TNM分期较晚显著相关，可通过阻止G0/G1～S期转变并抑制体内肿瘤生长，从而抑制结肠癌细胞的体外增殖。此外，生物信息学分析表明，3种 miRNA（miRNA-18a、miRNA-18b、miRNA-4733）含有CASC2结合位点。荧光素酶实验进一步证实了CASC2和miRNA-18a之间的相互作用。重要的是，原发性大肠癌组织中CASC2和miRNA-18a水平呈负相关。CASC2通过使miRNA-18a海绵化降低STAT3蛋白质抑制剂（protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3）的表达，从而抑制信号转导及转录激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）下游基因的表达[14]。大肠癌组织的临床样本分析也支持CASC2和PIAS3之间的关系。这些结果表明，CASC2在大肠癌的发展中具有关键作用。另有研究发现，hsa-miRNA-21对CASC2的调控也可以促进结直肠腺癌细胞的增殖和迁移[15]。

HOXA-AS3是神经胶质瘤组织中最显著上调的lncRNA之一，作为神经胶质瘤患者的独立预后因素，HOXA-AS3沉默通过改变细胞周期进程和促进细胞凋亡而导致细胞增殖停滞，并抑制神经胶质瘤细胞的迁移[16]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4（serine/threonine-protein kinase 4，STK4）-AS1与肿瘤抑制因子STK4相关，而STK4的下调与结直肠癌的侵袭和迁移有关。STK4被认为是潜在的肿瘤抑制因子，不仅可作为患者预后的预测因子，还可抑制结直肠腺癌转移，STK4表达缺失与COAD患者预后不良有关。对于lncRNA AL078459.1和AL390066.1，目前尚未在肿瘤中报道任何功能性作用。

4 未来展望

迄今为止，关于lncRNA及其相关的ceRNA网络在COAD中价值的研究报道甚少。Yue等[17]证明长基因间非编码RNA 152（long intergenic noncoding RNA 152，LINC00152）通过充当ceRNA来海绵化miRNA-193a-3p从而调控erb-b2受体酪氨酸激酶 4（erb-b2 receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）的表达，与结肠癌的预后不良相关。Fang等[18]研究报道，lncRNA HNF1A-AS1通过充当ceRNA来调节miRNA-34a的表达，在结肠癌转移中发挥癌基因的作用，可能是一种新的预后生物标志物，并可能成为结肠癌的潜在治疗靶标。Su等[19]揭示lncRNA BLACAT1可以通过与EZH2结合而抑制p15的表达，并且是结直肠癌预后不良的独立危险因素。本文通过对lncRNA相关的ceRNA网络进行全面分析，重点关注COAD发展过程中新的潜在生物标志物和可能的治疗靶点，未来需通过大规模的动物实验及临床研究证实这种关联，将这种潜在的生物标志物应用于COAD的早期诊断、预后预测。

5 小结

综上所述，COAD的诊断、治疗及预后是目前临床研究的热点，对lncRNA相关的ceRNA网络中COAD潜在的生物标志物进行全面分析，能够为临床中COAD的早期诊断、治疗优化、预后评估提供一定的帮助。