山羊伪结核棒状杆菌病流行现状和防控技术研究进展

曹启航，姜悦才，张天亮，冯舒童，马文涛*，陈德坤*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西千阳莎能奶山羊发展有限公司, 陕西千阳 721100)

山羊伪结核棒状杆菌病是由伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,CP)引起的一种人畜共患病和慢性接触性传染病，又称为山羊干酪性淋巴结炎(Caseous lymphadenitis,CLA)。该病多发生于山羊和绵羊，前期主要表现为颌下、肩前和腹下等部位的浅表淋巴结肿大，呈椭圆形肿块，质地较软且无发热；中期肿块较硬且局部发热，穿刺后内容物呈暗红色炎性脓汁；后期肿块破溃，内容物呈带血豆渣样脓汁，因细菌未被彻底清除，可能会在患部或周围部位产生新的脓肿。大多数患羊出现腹泻、渐进性消瘦甚至死亡，死后剖检可见内脏器官肿大、脓肿。目前，该病呈全球性分布且尚无快速、简便的诊断技术。由于该病发展缓慢，集约化养殖往往难以发现且难以彻底根除，导致病羊生产和繁殖能力下降，严重影响养羊业发展，威胁人类健康。论文主要从生物学特性、流行现状、疾病的诊断和防控方面对该病的研究进展情况进行综述，以期为该病的防控提供参考。

1 伪结核棒状杆菌的生物学特性

1888年，Edward Nocard在患有淋巴结炎的奶牛体内首次发现伪结核棒状杆菌。1891年，Preisz在母羊的类似结核病变组织中成功分离到该菌，因其与结核分支杆菌的干酪样结节形态相似，将其命名为伪结核杆菌[1]。1948年，在第6版《伯杰系统细菌学手册》中被正式命名为伪结核棒状杆菌，又称为假结核棒状杆菌[2]。

CP为革兰氏阳性兼性胞内寄生菌，无芽孢，无荚膜，有菌毛。大小约为0.5 μm×(1.0～3.0)μm，其形态主要呈球杆状[3]。该菌在37 ℃、中性条件下生长良好。该菌的生存能力较强，可在干燥、低温和高盐等环境下生长，在自然环境下能存活较长时间。接种在普通固体培养基时，细菌生长稀疏；在血平板生长的菌落起初如针尖大小，随着细菌不断生长，菌落逐渐变大且不透明，还会产生较窄的β-溶血环。该菌在土壤、水源、皮肤和感染部位等均能被发现[4]。

2 山羊伪结核棒状杆菌病的流行现状

该病在封闭集约化养殖场中多发，与品种无关。主要在成年母羊中易感，3岁羊居多，2岁和4岁次之，1岁和5岁以上更少。全年均可发生，但以春夏季节为主，其中7月份最高，5、6、8、9月份次之，其他月份更少[5]。山羊主要通过破损的皮肤黏膜接触被污染的饲料、器具、粪便和环境等途径感染，还可经呼吸道吸入污染的气溶胶颗粒而感染。

据报道，CP在全球范围内广泛分布，涉及欧洲、美洲、澳洲、非洲和亚洲等地区。澳大利亚西部的羊群患病率为20%以上，新西兰的成年羊的患病率为7.1%，美国西部母羊的患病率高达42.5%，加拿大成年羊的患病率达到36%左右[6-7]。因此，也可证明该病患病率与年龄相关，大多成年羊群会发病。刘昭平[8]对福建福安市周边羊场进行调查发现，其中发病羊场占60%以上，发病率高达20%；有研究人员调查发现，该病在广西马山县的年发病率约为10%[9]；郑国英等[10]对昆明市西山区的38 225只山羊进行流行病学调查发现，该病的发病率约为10.3%，病死率为0.1%左右；2018年，该病在贵州黔东南州首次被发现[11]。张斯旂等[12]对四川3个县的山羊养殖场进行皮下脓肿的流行病学调查，结果发现其发病率在3.0%～6.5%，经检测CP的分离率为57.9%；还有研究者对重庆地区80份山羊体表型淋巴结炎病原菌进行检测，发现伪结核棒状杆菌与金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌混合感染检出率分别为12.5%和3.75%[13]。李晨露等[14]对陕西省部分地区奶山羊养殖场进行流行病学调查，经抗体水平检测发现，羊伪结核棒状杆菌抗体阳性率为16%～34%。这表明该病在我国各地均有报道，其发病率明显升高且存在混合感染情况。因为该病对养羊业发展造成的巨大损失和危害，被我国列为三类动物疫病，其防控形势依然严峻[15]。

3 山羊伪结核棒状杆菌病的诊断方法

3.1 病原学诊断

3.1.1 病原菌的分离培养鉴定 首先，选取脓肿完整的患羊，经局部剪毛消毒后切开脓肿，无菌采集脓汁病料。其次，使用灭菌生理盐水稀释脓汁，经涂片革兰氏染色后镜检。可看到大量棒状或球杆状细菌，革兰氏染色为阳性，无芽孢、鞭毛及荚膜，呈散在排列。最后，进行细菌分离培养，将脓汁分别接种在普通琼脂平板、100 mL/L犊牛血清琼脂平板和麦康凯平板，37 ℃培养24 h后，血清琼脂平板上菌落呈白色半透明状凸起，周围有狭窄的β-溶血环，而在普通琼脂平板上生长较差，在麦康凯平板上不生长。挑取单菌落接种在普通肉汤和100 mL/L犊牛血清肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后，可看到轻度浑浊，尤其是血清肉汤培养基，还会有菌膜生成[12]。

3.1.2 病原菌的生化特性鉴定 取指数生长期的细菌接种于各生化鉴定管中，37 ℃培养24 h～48 h后发现，该菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和果糖，不能发酵山梨醇、甘露醇和肌醇；能分解尿素，不能分解硝酸盐，不产生硫化氢，不液化明胶；接触酶试验阳性，MR、VP试验均呈阴性[16-17]。

3.1.3 病原菌的特征性鉴定 由于CP与马红球菌共同培养时，可使β-溶血环增大，促进红细胞溶解作用。同时CP还对葡萄球菌β-溶解酶产生的溶血具有抑制作用[18]。由于溃疡棒状杆菌也分泌磷脂酶D(phospholipase D,PLD)，因此在使用协同溶血试验和溶血抑制试验后，还需结合其他方法对二者进行鉴定。

3.2 血清学诊断

相较于病原分离鉴定的诊断方法，研究人员更倾向于选择血清学诊断方法。该方法利用抗原抗体的特异性反应对CLA进行诊断，具有快速、准确、简便且不易造成污染等优点，在群体流行病学调查和亚临床感染病例的筛选等方面具有巨大优势。常见的血清学诊断方法包括：体内试验、菌体凝集抑制试验、间接血凝试验、双重免疫扩散试验、补体结合试验和和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，其中ELISA方法具有良好的应用前景并被广泛应用。

体内试验是通过给实验动物注射疑似阳性血清，观察其能否降低死亡率，即可对抗毒素进行检测。Seyffert N等[19]使用CP的培养上清液作为包被抗原，建立的间接ELISA对220份血清样品进行检测，其敏感性和特异性分别为93.5%和98.5%。魏宇辰[20]使用纯化的PLD融合蛋白作为包被抗原，建立的间接ELISA阳性血清稀释比值高，与羊口疮、羊乳房炎和羊溶血曼氏杆菌病无交叉反应，组间和组内的变异系数较低，具有灵敏、特异和重复性良好等优点，可用于羊群中伪结核棒状杆菌的检测。Farias A P等[21]选择rSodC融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA，其灵敏度和特异性分别为96%和94%，可用于羊群的流行病学调查。Miriam F R等建立的ELISA测定山羊和绵羊白细胞中IFN-γ的水平，结果发现感染CP患羊体内的IFN-γ水平较高，IFN-γ可作为检测患羊的潜在标志物[22]。

3.3 分子生物学诊断

羊伪结核棒状杆菌病的分子生物学诊断，根据该菌的全基因组序列，筛选特异性基因并设计引物，采用常规PCR即可进行诊断[23]。马玉馨等[24]建立了荧光定量PCR，其检测敏感度为常规PCR的1 000倍。如果患羊为内脏型病变，需对动物进行解剖。还可根据原核生物的16S rRNA设计通用引物，PCR扩增后结合高通量测序进行序列比对，进一步诊断病原菌[25]。由于伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌均能引起山羊皮下脓肿，杨发龙等[26]建立的多重PCR可同时检测这3种病原菌，该方法特异性强，检测下限分别为8.7×102CFU/mL、1.1×102CFU/mL和5.1×102CFU/mL，为临床快速诊断提供技术支撑。许国洋等[27]利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)可选择性穿透死菌细胞膜的特性，建立了伪结核棒状杆菌PMA-PCR检测法，该方法的特异性和灵敏性较高，能防止死菌DNA扩增的干扰，从而对活菌进行准确检测。

4 山羊伪结核棒状杆菌病的防控技术

4.1 疫苗预防

4.1.1 灭活疫苗 灭活疫苗的免疫效果主要取决于灭活方式和佐剂种类。有研究为了探究二者对疫苗免疫效果的影响，通过检测小鼠体内抗体，发现使用甲醛灭活、不完全弗氏佐剂的疫苗免疫效果最佳[28]。Fontaine M C等[29]使用经福尔马林灭活的CP和氢氧化铝佐剂对羊进行免疫接种，结果表明该疫苗对机体提供了良好的免疫保护作用，阻止了感染在接种部位以外的传播。

4.1.2 弱毒活疫苗 由于CP是一种胞内寄生菌，灭活疫苗仅能刺激机体产生体液免疫且维持时间短，成本高需多次注射，弱毒活疫苗的研究有望解决这一问题。弱毒活疫苗能持续刺激机体免疫系统，但其安全性较灭活疫苗低，具有不稳定易失活、存在毒力返祖的风险。目前，主要通过筛选弱毒株或人工致弱的方法来获得，其中人工致弱方法包括：改变物理化学因素、非易感动物的体内连续传代和基因编辑技术等。由于铁的摄取被认为是胞内细菌感染过程中的毒力因素之一，有研究通过随机诱变鉴定了21种不同的CP突变株，并使用铁缺乏突变株CZ171053对小鼠进行免疫接种试验，强毒株攻击后发现，免疫动物的存活率达到80%，同时该突变株可有效抑制细菌的胞内生长[30]。Simmons C P等[31]研究发现，伪结核棒状杆菌aroQ突变体制备的疫苗免疫原性降低，仅能减弱临床症状而无法诱导淋巴细胞分泌特异性IFN-γ，导致该弱毒活疫苗不能对机体提供免疫保护。

4.1.3 类毒素疫苗 伪结核棒状杆菌病类毒素疫苗的主要成分是PLD，此抗原成分是将CP的培养上清液经过滤和浓缩得到，再用福尔马林灭活成类毒素。Eggleton D G等[32]使用类毒素疫苗对绵羊进行免疫接种，6个月后再通过感染病原菌来评估免疫效果，结果发现病变羊只的数量显著减少，疫苗免疫保护效果良好，感染率明显降低。有研究对两种市售的类毒素疫苗的免疫效果进行评价，通过ELISA检测发现，接种绵羊体内对这两种疫苗均产生了抗体反应，相比于对照组，机体脓肿数量显著减少，此疫苗可有效控制该病的传播和流行[33]。

4.1.4 重组亚单位疫苗 Silva M T等[34]使用rCP09720和rCP01850蛋白与重组磷脂酶D(rPLD)的亚单位疫苗免疫小鼠，经病原菌株攻击后，两个试验组的总IgG和IFN-γ水平显著增加，且仅在后者中TNF水平显著增加；小鼠的存活率分别为40%和50%，而单独使用rPLD的小鼠存活率为30%，表明rPLD与rCP09720和rCP01850联用对抗感染免疫具有协同作用，尤其后者的保护作用更强，可诱导更强烈的细胞免疫反应。还有研究将CP的rNanH和rPknG两个假定毒力因子作为重组亚单位疫苗，通过对小鼠两次免疫接种发现，免疫组的抗体水平较高，IL-17、TNF和IFN-γ的表达水平升高，存活率分别为60%和20%，表明前者可引起细胞免疫反应，可被作为该病原菌的有效疫苗[35]。

4.2 手术治疗

患部剪毛消毒，当脓肿较小时，切开脓肿将脓汁排出，用消毒液反复冲洗(如新洁尔灭、30 mL/L双氧水和1 mg/mL高锰酸钾等)，再涂抹碘酒消毒，并使用红霉素软膏、环丙沙星和庆大霉素等高敏药物涂抹伤口，每天1次，直至愈合；当脓肿较大时，应仔细剥离脓肿包膜，还要注意是否形成瘘管。在外科处理过程中，要注意环境的消毒和化脓废弃物的无害化处理，不能随意丢弃，防止病原菌扩散，同时还应做好个人安全防护[8]。

4.3 病原净化

目前，山羊集约化养殖过程中疫病防控尤为重要，由于手术治疗效果不佳、效率低且易污染环境。疫苗预防接种将有效提高山羊免疫保护力，防止羊群大规模传染、发病。CP的净化主要从以下两个方面入手：一是羊群净化，分别使用病原学、血清学和分子生物学等检测方法，评估目标羊群CP的感染情况。结合检测结果分析山羊伪结核棒状杆菌病在邻近地区的整体流行情况，并制定科学合理的净化程序：疫苗免疫接种病原阴性的羊群、隔离检测新引入的羊群、隔离治疗病原阳性的羊群、及时淘汰临床症状严重的患羊、定期对羊群进行抗体水平检测等。当羊群中该病检测结果均为阴性时，则基本可以达到疫病的净化。二是养殖环境净化，定期对羊场饲养器具及圈舍内外环境进行全面消毒与杀菌，并做好个人防护，及时清理污粪并发酵处理，切断传染源和传播途径，避免羊群进一步接触病原菌，维持健康的养殖环境，达到对环境中病原净化的目的。

5 发展趋势

由于山羊伪结核棒状杆菌病是一种接触性的人畜共患传染病，因此还需在山羊胴体上市前加强对该病原菌的监测，以防止流入市场。由于药物治疗效果不佳且会产生多重耐药，因此，该病的治疗应避免抗生素等药物的滥用。为开发高效疫苗，不但要将抗原和不同佐剂组合以获得更强的细胞免疫反应，而且应尽可能使用小反刍动物模型以提供更加可靠的结果。该病的诊断和防控技术正向着高效、灵敏、快速、便捷和低成本的方向发展。同时，还将会应用到更多的新兴技术、寻找特异性位点等，从而得到准确的结果并保护动物免受感染，推动山羊养殖业的健康发展。