副鸡禽杆菌研究进展

刘栋辉,郭梦娇,张 昊,谭惠惠,靳逸昆,张小荣,吴艳涛

(扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009)

副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)最早于20世纪30年代被报道，之前被称为副鸡嗜血杆菌，2005年Blaclall P J将其重新命名为副鸡禽杆菌[1]。感染副鸡禽杆菌会引起一种鸡的急性上呼吸道疾病——传染性鼻炎(Infectious coryza,IC)。一般情况下该病的潜伏期较短、发病急且传染性强，病死率低。但与其他病原如支原体、传染性支气管炎病毒、腺病毒等发生混合感染时，病死率会显著升高[2-3]，给养殖场造成巨大经济损失。

1 副鸡禽杆菌的病原特性

1.1 病原简介

副鸡禽杆菌为革兰氏阴性短杆菌，无鞭毛，其毒力菌株常常存在荚膜结构。该菌为兼性厌氧菌，液体环境培养时无需补充CO2，但在固体培养基上培养时需提供厌氧环境或体积分数为3%～10%的CO2。其生长繁殖速度较慢，营养需求较高，在普通培养基上不生长，体外培养时一般需要添加V因子，但也存在非V因子依赖的副鸡禽杆菌菌株[4]。固体培养基上生长24 h形成针尖大、圆形、灰白色半透明的菌落。在血琼脂上与金黄色葡萄球菌交叉划线培养，可以观察到“卫星现象”。在临床分离细菌时需要注意，副鸡禽杆菌对外界环境抵抗力不强，因此现场采集的病料要尽快进行细菌分离，否则可能无法分离到活菌。

1.2 分型方法

最初Page采用玻板凝集方法将副鸡禽杆菌分为A、B、C 3个血清型。后有研究表明，通过血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)进行副鸡禽杆菌的Page分型更为有效[5]。虽然也出现部分分离株无法分型的情况，但Page分型方案仍是目前应用最广的副鸡禽杆菌血清学分型方案。Kume等进一步通过血凝抑制试验将副鸡禽杆菌分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 共3个血清群9种血清型，并将其与Page方案对应，划分出A1、A2、A3、A4、B1、C1、C2、C3和C4共9个血清型，但由于其过程繁琐、试验条件较苛刻，所以应用范围较窄[6]。在对微生物的研究中，基于DNA的分子生物学分型方法更为便捷。一些研究也对副鸡禽杆菌的基因分型方法进行了探索，Sakamoto R等[7]提出以副鸡禽杆菌的hmtp210基因的高变区为靶标，使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RPLP)和多重PCR(multiplex PCR,mPCR)方法来进行分型，但这两种方法在之后的研究中被证明并不可靠，不能用来代替Page或Kume分型方案[8]。之后Tan D H等[9]通过分析副鸡禽杆菌hmtp210基因序列和血清型之间的关系发现，使用hmtp210基因的部分序列进行遗传进化分析,可以用来区分A、B、C 3种血清型，该研究为开发与副鸡禽杆菌血清学分型相对应的分子分型方法提供了新方案。

1.3 鉴别诊断

在诊断传染性鼻炎时，除了进行病原菌的分离培养及生化特性鉴定外，目前广泛使用陈小玲等[10]建立的PCR鉴定方法(HPG2-PCR)进行诊断。钱琳娜等[11]开发了针对鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)、滑液囊支原体(Mycoplasmasynovium，MS)和副鸡禽杆菌的三重PCR，通过测试表明,其建立的三重PCR诊断技术具有良好的特异性和较高的灵敏性，可用于临床上对这几种常见的鸡呼吸道疾病的鉴别诊断。Clothier K等[12]在HPG2-PCR的基础上，开发实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法用于样品的快速检测，该方法灵敏度高、特异性好，最低检出率为10 CFU/mL。梅晨等[13]原核表达了副鸡禽杆菌的血凝素蛋白HMTP210中保守的P9片段，并以该蛋白为抗原开发了一种间接ELISA检测方法，该方法可以检测出3个血清型的副鸡禽杆菌的阳性鸡血清，并且在测试中与其他禽病的病原体抗血清无交叉反应。

1.4 毒力因子

1.4.1 血凝素蛋白 血凝素蛋白是副鸡禽杆菌重要的一种免疫保护性抗原，相应的血凝抑制抗体水平也被作为评价传染性鼻炎疫苗免疫保护效果的重要指标。有研究认为外膜蛋白HagA是副鸡禽杆菌的血凝素蛋白[14]。但进一步研究发现，虽然重组HagA蛋白表现出血凝活性，但并不存在血清特异性，不同血清型菌株间的HagA蛋白编码基因同源性在95%以上。使用相应的单克隆抗体或全菌多克隆抗体也不能使该蛋白出现血凝抑制，且对致病菌株的免疫保护效果中等[15]。因此认为HagA蛋白可能只是一种副鸡禽杆菌的普遍抗原，并不是主要诱导产生血凝素抑制抗体的血凝素蛋白，而其表现出的血凝性可能是由于该蛋白具有与细菌黏附定植有关的功能而与红细胞产生的交叉反应。而HMTP210蛋白已被证实是副鸡禽杆菌的血凝素蛋白，该蛋白是与细菌的生物被膜形成和黏附宿主细胞有关的一种黏附素，主要以三聚体形式存在。缺失了hmtp210基因的副鸡禽杆菌菌株失去了血凝活性且不能诱导机体产生血凝抑制抗体[16]。不同血清型的HMTP210中间部位存在一段高变区，而上、下游序列高度同源，这提示该蛋白的高变区可能与菌株的血清特异性相关。

1.4.2 内源性质粒 质粒是独立于细菌基因组之外的携带遗传信息的环状DNA分子，可以携带耐药基因或其他功能元件，使细菌产生耐药性等，是影响细菌毒力的重要因素。2007年，Hsu Y M等[17]从副鸡禽杆菌分离株中鉴定了一种耐药性相关质粒pYMH5。该质粒携带sulⅡ、strA、mbeCy、aphAⅠ4个耐药基因。质粒上还可能携带着某些特殊基因，对菌株的生长特性或者毒力产生影响。Terry T D等[18]在当地分离株中发现一种大小为6.29 kb质粒p250。该质粒上有一个细菌素产生位点，且与流感嗜血杆菌的相关基因高度同源。Hsu Y M等[17]还检测到另一种质粒pA14，该质粒可以编码MglA蛋白和RNase Ⅱ，推测与副鸡禽杆菌的毒力有关。

1.4.3 其他毒力因子 随着研究的深入，副鸡禽杆菌的其他毒力因子被不断鉴定和分析，如荚膜、菌毛蛋白、脂多糖、RTX(repeats-in-toxins)毒素等。副鸡禽杆菌强毒株均具有荚膜，但在传代过程中会失去荚膜形成能力，从而导致菌株毒力降低，不能引起传染性鼻炎特征性症状。Liu C C等[19]发现，FlfA重组蛋白作为传染性鼻炎的亚单位疫苗对相应野生型菌株有一定的保护作用，研究中构建的菌毛蛋白编码基因flfA缺失株的毒力也显著低于野生型。Küng E等[20]报道了一种在副鸡禽杆菌中常见的RTX毒素AvxA，该种毒素蛋白会导致宿主细胞和组织发生损伤，并破坏机体的防御功能[21]，该毒素可能与副鸡禽杆菌定植呼吸道后引起的机体损伤有关。

2 流行情况

传染性鼻炎一年四季都可发生，季节更替时多发。以育成鸡和产蛋鸡发病较多，此外还有关于野鸡和鹌鹑等感染发病的报道。该病目前在中国、美国、墨西哥以及南非等世界各地均有报道[22-23]，近年来，我国多个地区的发病率也呈上升趋势。龚玉梅等[24]的报道显示，在2012年-2017年6年间从我国各地送检病料中分离的45株副鸡禽杆菌中，主要流行的副鸡禽杆菌为B血清型，有30株分离株；其次为A血清型，有15株分离株；未检测到C血清型。冀笑明等[25]在2018年-2019年对山东、河南、河北及江苏等地的发病鸡群进行细菌分离鉴定中，共分离得到87株副鸡禽杆菌。其中包括血清A型20株、血清B型57株、血清C型10株，这表明副鸡禽杆菌在我国的暴发和流行愈发严重，且A、B、C 3种血清型的副鸡禽杆菌在我国均有流行，B血清型与之前的流行情况类似，依然是国内主要流行株。赵怡等[26]的调查结果显示，2019年在其从各地分离到副鸡禽杆菌的15组病料中，10组为A型菌感染，5组为C型。综合来看，目前我国副鸡禽杆菌流行态势较之前有了一些变化，虽然我国目前仍然是3种血清型均有流行，但之前一直占主导地位的B血清型的发病率有所下降，而C血清型的发病率则在逐渐升高。

3 副鸡禽杆菌病的防控方法

3.1 药物治疗

当养殖场暴发传染性鼻炎时，可使用抗菌药物进行治疗。针对传染性鼻炎治疗效果较好的有磺胺类、四环素类以及链霉素等氨基糖苷类药物，但是目前病菌对抗菌药物的耐药性目前比较常见。因此在临床治疗时，需要对分离株进行药物敏感性试验，从而确定最佳用药方案。此外，需要注意药物的用法用量及给药时间：产蛋期不可使用磺胺类药物[27]。可适当延长药物治疗时间，以防传染性鼻炎未被完全治愈，反复发作；同时为了避免病菌在治疗过程中短时间内产生耐药性，可进行穿梭用药、轮换用药等。

3.2 疫苗研究

3.2.1 灭活苗 疫苗防控是目前防控传染性鼻炎的一种重要手段，常用的有二价苗和三价苗[28-29]。由于不同血清型之间交叉保护效果较差，并且我国3种血清型均流行，因此目前多应用A、B、C 3个血清型的三价灭活疫苗进行免疫[30]。如Gong等研制出副鸡禽杆菌的油乳剂三价灭活疫苗，在两次免疫后9个月，对 A、B、C 3型副鸡禽杆菌攻毒的保护率仍然不低于80%[31]。此外，也可联合其他病原体制备多联苗，如副鸡禽杆菌二价或三价和鸡毒支原体的二联油乳剂灭活苗等。但副鸡禽杆菌全菌灭活疫苗一方面培养成本较高，另一方面革兰氏阴性菌中脂多糖、荚膜等菌体蛋白会引起机体副作用，加上灭活苗注射量较大，会进一步加重疫苗的副作用[32]。

3.2.2 基因工程疫苗 基因工程疫苗的开发需要探究病原体的免疫保护抗原和毒力因子等，目前研究的主要有弱毒苗和亚单位疫苗。如Wang Y P等[16]构建了hmtp210基因缺失株，并验证缺失株的毒力相比于野生型明显降低。Tu T Y等[33]构建了副鸡禽杆菌荚膜形成相关基因hctA基因缺失株，并验证缺失株的毒力较野生型减弱。这些基因缺失株将来可以作为传染性鼻炎的弱毒苗候选株。亚单位疫苗也是副鸡禽杆菌基因工程疫苗研究的重点，Noro T等[34]表达的重组血凝素蛋白对同源菌株可产生100%的保护率。Sakamoto R等[35]将A型和C型副鸡禽杆菌的HMTP210的高变区进行融合表达，用该融合肽制备的疫苗接种35日龄SPF鸡。攻毒结果显示免疫鸡不表现临床症状，且接种部位无肿胀等不良反应。赵成全等[36]根据副鸡禽杆菌外膜蛋白GcbG研制的亚单位疫苗的保护率优于全菌灭活疫苗，可达90%。Mei C等[37]发现副鸡禽杆菌的外膜囊泡可为同种血清型提供较好的保护性，但对不同血清型交叉保护性较弱。这提示外膜囊泡可作为一种潜在的新型替代疫苗。

4 小结

副鸡禽杆菌感染鸡会引起传染性鼻炎，对鸡的生产性能会造成较大影响，如引起育成鸡生长不良、产蛋鸡产蛋下降等，若与其他病原如支原体、传染性支气管炎病毒等混合感染会造成更大的损失。近年来传染性鼻炎发病率呈逐年上升趋势，提高饲养管理水平、做好生物安全措施，再加上合理的疫苗接种是目前应对传染性鼻炎较为有效的防控手段，但仍需进一步探究副鸡禽杆菌的致病机制以及新型防控措施。