凝血因子Ⅴ与出血和血栓的相关性研究进展

李可可，肖 扬

（1.东莞东华医院，广东 东莞 523129；2.深圳市前海蛇口自贸区医院，深圳 518067）

凝血因子（coagulation factor，F）Ⅴ也被称为促凝血球蛋白原或易变因子。FⅤ作为凝血酶原复合物中活化的FⅩ（activated coagulation factor Ⅹ，FⅩa）的辅因子，对促进“凝血级联”反应的凝块形成极为重要。除了促凝活性外，FⅤ还可作为活化蛋白C（activated protein C，APC）的辅因子参与FVⅢa灭活，发挥其抗凝作用，并作为组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的辅因子，和TFPI/S蛋白（protein S，PS）形成三联复合物（TFPI/PS/FⅤ），通过抑制FⅩa活性发挥其抗凝作用[1]。遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症（hereditary coagulation factor Ⅴ deficiency，FⅤD）是一种罕见的出血性疾病，但患者出血严重程度不等，很少出现危及生命的大出血[2]。F5基因功能缺陷型突变会导致FⅤD，重型FⅤD患者出血严重程度存在差异，有可能和基因突变类型有关[3-4]。F5功能获得型突变则与血栓发生有关。本文对FⅤ的生物学特性进行概述，并介绍F5功能缺陷型突变与出血和F5功能获得型突变与血栓的关系。

1 FⅤ的生物学特性

正常人体中，约80%的FⅤ存在于血浆中，20%存在于血小板α颗粒中。血浆FⅤ主要由肝脏合成，虽然巨核细胞也能够合成FⅤ，但血小板FⅤ主要来源于血浆池。骨髓巨核细胞通过类似胞吞的机制将血浆FⅤ转化为血小板FⅤ，并将其储存在α颗粒中[5]。

血浆FⅤ是一种相对分子质量约为330 000的多结构域的单链糖蛋白（A1-A2-B-A3-C1-C2），以酶原形式在血浆中循环。B结构域中含有高度保守的碱性区域（aa963-aa1008）和酸性区域（aa1493-aa1537），二者的高亲和力结合使FⅤ形成一个球状结构，该结构可保护FⅤ的裂解位点不暴露，从而使FⅤ维持其酶原形式[6]。在FⅩa或凝血酶的作用下，血浆FⅤ于Arg709、Arg1018和Arg1545位点水解，释放B结构域，转化为有活性的FⅤ（FⅤa），其中Arg1545是关键切点[7]。血浆FⅤa由1条重链（A1-A2）和1条轻链（A3-C1-C2）组成，由Ca2+连接在一起。在凝血级联反应中，在存在Ca2+的条件下，FⅤa作为FⅩa的辅因子，通过与FⅩa高亲和力结合，于活化血小板的磷脂膜上形成凝血酶原复合物（FⅤa/FⅩa/PL），高效加速凝血酶原的激活，发挥促凝作用[8]。FⅤa在APC/PS复合体的作用下，于Arg306、Arg506和Arg679位点裂解灭活[9]。

最新研究发现，与血浆FⅤ相比，血小板FⅤ具有更强的促凝活性[10]。可能的原因为：（1）血小板FⅤ在被FⅩa或凝血酶激活为FⅤa之前，就已经以部分活化的形式存在；（2）相比于血浆FⅤ，血小板FⅤ可更快地被FⅩa激活[11]；（3）血小板聚集于血管受损处，活化的血小板从α颗粒中释放FⅤ，导致血小板膜表面局部FⅤ浓度偏高[12-13]；（4）血小板FⅤa和血浆FⅤa被APC在相同的识别位点裂解，但血小板FⅤa的蛋白水解速度较慢，不能被APC完全灭活[14]。

FⅤ除了以FⅤa形式作为FⅩa的辅因子发挥促凝作用外，也具有抗凝作用[15]。其抗凝作用主要包括以下2个方面：（1）FⅤ可作为APC/PS复合物的辅因子，参与FⅧa的灭活[16]；但FⅤ只有在Arg506位点被APC剪切后，将FⅤ转化为几乎没有任何促凝特性的抗凝蛋白，才发挥其辅因子的抗凝特性；FⅤ在Arg1545位点被凝血酶剪切后，失去了其作为APC/PS复合物的辅因子抗凝功能，但在Arg709和Arg1018位点上的剪切则不会影响其抗凝功能[17]；（2）作为TFPI的辅因子，FⅤ可与TFPI/PS形成三联复合物——TFPI/PS/FⅤ，发挥抑制FXa的作用[18]。

2 F5功能缺陷型突变与出血

FⅤD是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，是由F5功能缺陷导致的[19]；在人群中的发病率约为百万分之一[20]。迄今为止，有180多种与FⅤD相关的突变（人类基因组突变数据库www.hgmd.cf.ac.uk）被报道，类型有同义突变、错义突变、无义突变、剪接位点突变、缺失和插入等[21]。FⅤD患者的临床出血表现不一，从无症状到危及生命的出血都有发生[22]。轻度（FⅤ：C≥10%）和中度（FⅤ：C＜10%）FⅤD通常无临床症状，重度（FⅤ：C＜1%）FⅤD患者的临床表型具有一定的异质性，部分重度FⅤD患者一般只表现为皮肤瘀斑、鼻衄、月经过多和术后出血增多等轻、中度出血，但也有重度FⅤD患者表现为颅内出血、消化道出血、脐带出血等危及生命的出血。推测这种异质性或与FⅤD患者的F5突变类型有关[10，22]。轻、中度出血多见于F5突变类型为错义突变、无义突变、小的缺失和插入的重型FⅤD患者[21，23-24]；而危及生命的出血则常见于F5突变类型为剪切位点突变、大段缺失以及深部内含子变异的重型FⅤD患者[25-27]。这可能是因为无义突变、错义突变、小的缺失和插入等突变类型只影响FⅤ蛋白的局部功能，对其促凝结构域的影响不大，但大段缺失、剪切位点突变以及深部内含子变异这些突变类型会导致FⅤ蛋白缺失。

可能是因为微量的FⅤ即可产生足量凝血酶，部分重度FⅤD患者的出血并没有想象中的那么严重[28]。DUCKERS等[29]通过凝血酶生成试验（thrombin generation assay，TGA）发现，在乏血小板血浆中，10%的FⅤ即可产生正常量的凝血酶。TGA是一个可系统监测待测标本中凝血酶生成总潜力的试验，采用TGA实时监测凝血酶的含量可以有效地评价出血或血栓形成的风险[30]，尤其是对于轻、中度出血的重型FⅤD患者[31]而言，TGA有助于预测其出血风险。DUCKERS等[32]对重型FⅤD患者的富血小板血浆进行TGA，发现即使使用高浓度的组织因子触发凝血酶生成，在重度FⅤD患者的乏血小板血浆中也未观察到凝血酶产生，但在相应的富血小板血浆中则观察到在低浓度组织因子中已产生可观的凝血酶。这一现象可能是因为重度FⅤD患者虽然血浆FⅤ含量极低，但其血小板中仍含有一定量的FⅤ，可以代偿血浆中减少的FⅤ，发挥促凝功能。虽然FⅤD患者血浆FⅤ水平和血小板FⅤ水平同步降低，但因为血小板FⅤ比血浆FⅤ具有更强的促凝活性，而且血小板在受损部位可以快速释放FⅤ，形成局部高浓度，所以血小板FⅤ比血浆FⅤ促凝活性更高，极大地降低了FⅤD患者的出血风险。此外，FⅤ和生理抗凝物质TFPI可在血浆中形成复合物[33]，二者水平高度相关，从正常人群到部分（杂合子）再到严重（纯合子）的FⅤD患者，TFPI水平逐渐降低。TFPI的减少，也间接促进了凝血酶的产生[32，34]。

目前，治疗FⅤD的方法主要是输注新鲜冰冻血浆（fresh frozen plasma，FFP）和血小板[35-36]，使FⅤ水平维持在＞20%[37]。近年来，也有新兴技术被逐渐应用于FⅤD的治疗，如一种新型血浆衍生FⅤ浓缩物可在体外有效纠正FⅤ缺陷血浆的活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间，或可成为FⅤD治疗的有效药物[38-39]。令人惊喜的是，目前已经有新技术通过F5修复来治疗FⅤD患者，有学者通过对FⅤD患者生成诱导多能干细胞iPSCs，并应用CRISPR相关技术修复了F5的突变，恢复了FⅤD患者的FⅤ活性水平[40]。

3 F5功能获得型突变与血栓

F5还有一些突变是功能获得型突变，这些突变常与血栓相关。FⅤLeiden是最常见的F5功能获得型突变，其是高加索人群静脉血栓形成最常见的遗传危险因素；在杂合状态下，静脉血栓栓塞的风险可增加5～7倍，纯合子的风险甚至更高[41]。FⅤLeiden使FⅤ蛋白第506位精氨酸被谷氨酸取代，FⅤa失去1个关键的APC剪切位点Arg506，导致APC抵抗，即APC无法有效灭活FⅤa和FⅧa，导致体内抗凝不足[42]。另1个APC的剪切位点突变也与血栓发生有一定关联，即FⅤ Arg306Thr（FⅤ Cambridge）[43]。临近Arg506剪切位点的突变亦可产生APC抵抗，如FⅤBonn（Ala512Val）[44]。除此之外，氨基酸序列上远离APC经典剪切位点的功能获得型突变也可导致APC抵抗，如日本学者发现的纯合突变FⅤNara（Trp1920Arg/W1920R）[45]与严重的深静脉血栓有关，该突变在一级结构氨基酸序列上与APC的剪切位点相距较远，但其可能通过影响FⅤ与APC的结合或FⅤ与磷脂的结合，进而影响APC的剪切效率。TGA同样可以应用于预测F5功能获得型突变血栓的形成。

目前，虽尚未见此类病例报道，但有理由推测F5功能获得型突变或可通过影响其TFPI的辅因子活性来减弱TFPI抗凝功能，进而导致血栓。有关F5突变与血栓之间的关联有待进一步研究加以证实。

4 总结

FⅤ具有促凝和抗凝双重作用，在止血和血栓的形成中均发挥重要作用。本文着重介绍了F5突变与出血和血栓之间的关联，该领域主要研究方向是通过研究F5的不同突变，以及对突变基因进行体外表达并对其进行TGA检测，从而更好地预测携带F5突变患者的出血风险或血栓形成的风险。尤其是FⅤD患者，由于FⅤ的活性水平与疾病的严重程度无明显关系，且其临床出血表现呈现一定的异质性，故对FⅤD患者进行F5突变检测和TGA检测，尽早预测出血风险尤为重要，特别是对于有手术需要的FⅤD患者，可以在很大程度上规避风险。此外，对于轻、中度FⅤD患者，虽然无明显出血倾向，但一旦患者合并病毒感染等其他突发事件，依然会增加出血风险，故需对此类情况予以足够的重视[46]。

对于一些有血栓形成风险的F5突变或不明类型的突变，采用TGA检测进行血栓或出血风险预测非常有必要。但目前基因检测成本较高，普及有一定的困难，而且FⅤ蛋白的体外表达较为困难，无法更好地研究某些突变所造成的影响，而且凝血酶生成仪器我国目前也仅有几台，对于采用TGA预测出血或血栓形成风险有很大的不便。FⅤ作为具有促凝和抗凝双重作用的凝血因子，对于阐明机体促凝与抗凝相互作机制有重要意义。随着科技的发展，基因检测技术和TGA检测将广泛应用于临床，为FⅤD患者或F5功能获得型突变患者带来福音。