不同水解方法对蚕丝蛋白水解多肽含量的影响*

李红梅，严丽君，刘 佳，杨 颖，李春华，金 鑫，王永超

(云南师范大学 职业技术教育学院，云南 昆明 650092)

蚕丝作为“纤维皇后”，其蛋白质含量丰富，可高达98%，是人类最早利用的天然蛋白质之一，蚕丝蛋白主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成[1]。丝素蛋白是没有生理活性的天然生物大分子之一，约占蚕丝质量的70%～80%，其二级结构以β折叠为主，分子构象稳定，与其它天然高分子相比，优点突出。研究表明丝素蛋白具有生物相容性好、无毒、无污染、无刺激性等特点[2]，由此研制出的人造皮肤、人造血管、人造肌腱和人造骨骼等可被用作不同组织修复的支架材料[3-4]。丝胶蛋白以鳞片状裹附在丝素外层，形成半透明胶体保护膜，约占蚕丝质量的25%，是一种球状蛋白，以无规则卷曲为主，分子构象比较松散和无序[5]，用来保护和胶粘丝素。丝胶拥有多种优良特性，如亲水性、粘性、抗菌性、抗氧化性等[6-7]。蚕丝的非服饰功能多采用丝素，且制取丝蛋白多以废茧丝为原料，不含生物活性成分，而对人体有危害的重金属和其他它有机物常附着在丝胶上，脱胶处理后的丝素蛋白对人体几乎没有影响[8]，因此，利用废茧丝来生产丝素蛋白不仅节约资源，且具有较高的经济价值。

在蚕丝蛋白的制取工艺中，最重要的是脱胶和水解两个步骤。常见的脱胶方法有碱法、盐法、酸法、酶法和高温煮沸法等。几种方法各有利弊，其中酶法脱胶效率较低;盐法脱胶很难除去可溶性盐，对设备要求较高，产品的光泽度会受到影响;酸碱法脱胶若处理不当常会对生态环境造成污染[9]。相入丽等采用高温煮沸脱胶法，此法不添加任何化学试剂，对设备要求不高，工艺流程简单，便于普遍推广[10]。

丝素肽是丝素蛋白的水解中间产物，其相对分子质量分布在300～20000 μ 范围内，控制水解程度可以得到不同相对分子质量的丝肽。李圣春等[11]研究表明丝素肽易被头发吸收从而增加头发的光泽度和弹性;丝素肽也是天然的保湿剂，可给肌肤提供营养，防止皮肤干燥龟裂;丝素肽能够抑制黑色素生成，美白嫩肤;丝素肽还可提供人体必需氨基酸，有效控制血糖、胆固醇，在预防自身免疫疾病上发挥重要作用;丝素肽还能用于隐形眼镜、人工角膜、人造皮肤和人造血管等生物材料的制造。口服毒性试验结果表明丝素肽作为化妆品原料是安全可靠的，可按任意比例与某些化妆品原料掺合，且可以不用加入乳化剂、分散剂等[12]。鉴于丝素肽的优良特性，其在护肤品、医药、食品、生物技术等方面具有广阔的应用前景。

由于丝素蛋白不溶于水，且很难被酶直接水解，目前常采用碱法和酸法水解丝素蛋白。谭晓慧[13]研究的碱法水解丝素蛋白的最佳水解条件为：加入质量分数为6% NaOH，料液比为 1 g∶100 mL，60 ℃ 水解 3 h。此法采用较低浓度的碱来水解，降低碱对氨基酸的破坏以及减少可溶性盐，反应时间较短，较为经济;但碱水解法制取的丝素肽相对分子质量较小，用到透析袋纯化时应注意透析袋的大小，以提高丝素肽的产量。酸法水解中的酸主要有盐酸、硫酸和磷酸，研究表明：盐酸法反应时间过长，对设备腐蚀性较强，且盐酸具有强挥发性，对空气造成严重污染，而且脱盐较难，所以酸法水解主要使用硫酸和磷酸做溶剂。硫酸水解法具有反应条件温和，产品质量好、产量高等优点，但其耗时较长，能耗较大;袁慧勇等研究得到的硫酸水解的最佳工艺为：加入98% 硫酸，料液比为1∶3，95 ℃ 水解 6 h[14]。李学军等探索出磷酸水解法水解丝素蛋白的最佳条件为：加入85% 磷酸，料液比为1∶4，95 ℃ 水解 6 h，得到复合氨基酸，该法在制取氨基酸和丝素肽时具有反应条件温和，时间较短等优点，缺点是水解温度较高，得到的多数是氨基酸[15]。

鉴于不同的蚕丝蛋白水解方法各有优缺点，有关各水解方法对水解丝素肽的含量影响仍缺乏系统的比较，这对丝素肽的规模化生产造成了一定的影响。因此，本文对不同水解方法对丝素肽含量的影响系统地进行比较研究，可为丝素肽的生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂和仪器

实验材料为市场购买的新鲜桑蚕茧。

实验试剂：NaOH、HCl、H2SO4、H3PO4、无水乙醇和蒸馏水等均为分析纯。其它主要试剂有15% 单宁酸、3% 茚三酮乙醇溶液、100 μg/mL 丙氨酸标准溶液、pH为5.4～5.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.2% 抗坏血酸溶液、活性炭、氧化钙、混合催化剂(0.2～0.3 g 硫酸钾和0.2～0.3 g 五水硫酸铜混合均匀)、硼酸、混合指示剂(0.1% 甲基红乙醇溶液和0.5% 溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合)。

电子天平：上海卓精;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：上海豫康科教仪器设备有限公司;安亭TDL-80-2B低速台式离心机; UV-2600型紫外-可见分光光度计，日本岛津;HR-500半自动凯氏定氮仪，上海华睿仪器有限公司。

1.2 蚕茧脱胶方法

本实验采用高温煮沸脱胶法进行脱胶。

家蚕→剪开除杂质→加入蒸馏水煮沸 4 h(多次翻拌，及时补加蒸馏水)→得到丝胶液及不溶物丝素，丝素用蒸馏水洗涤3～4次，低温烘干备用。

1.3 蚕茧丝素蛋白水解液的制备

1.3.1 H2SO4水解法

称取 3 g 经热水脱胶洗净并干燥好的丝素，以质量比为1∶3的比例与质量分数为98%硫酸混合于烧杯中，在油浴锅中以 95 ℃ 反应 6 h，中途不时用玻璃棒搅拌。反应结束后取出烧杯进行冷却，用石灰乳中和至pH值为中性或微酸性，再用活性炭吸附脱色、脱臭，得到的滤液即为硫酸水解法获得的水解液。

1.3.2 H3PO4水解法

称取 3 g 经热水脱胶洗净并干燥好的丝素，以质量比为1∶4的比例与质量分数为85%磷酸混合于烧杯中，在油浴锅中以 95 ℃ 反应 6 h，中途不时用玻璃棒搅拌。反应结束后取出烧杯进行冷却，用石灰乳中和至pH值为中性或微酸性，再用活性炭吸附脱色、脱臭，得到的滤液即为磷酸水解法获得的水解液。

1.3.3 NaOH水解法

称取 3 g 经热水脱胶洗净并干燥好的丝素，以质量比为1∶100的比例与质量分数为6%NaOH混合于烧杯中，在油浴锅中以 60 ℃ 反应 3 h，中途不时用玻璃棒搅拌。反应结束后取出烧杯进行冷却，用盐酸中和至pH值为中性或微酸性，再用活性炭吸附脱色、脱臭，得到的滤液即为氢氧化钠水解法获得的水解液。

1.4 多肽含量的测定

1.4.1 上清液中多肽含量的测定

蛋白质测定常采用凯氏定氮法，通过测出样品的总含氮量，再乘以蛋白质系数求得蛋白质含量。用单宁酸做蛋白沉淀剂，通过离心作用把样品中大分子蛋白质与小分子多肽分离，大分子蛋白质被沉淀在下层溶液中，小分子物质留在上清液中。上清液采用茚三酮显色法，在氨基酸标准曲线上找出相应的游离氨基酸含量。随后用上清液中总蛋白质含量扣除上清液中游离氨基酸含量，即可获得上清液中多肽含量。

ρ=N×6.25，

T=ρ-A。

式中：N—样品的含氮量，%;c—盐酸标准液的浓度，mol/L;V1—空白滴定消耗的标准盐酸的体积，mL;V2—样品消耗滴定消耗的标准盐酸的体积，mL;0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol;m—样品的质量，g;6.25为蛋白质系数;ρ为总蛋白质质量浓度，g/100 mL;T为多肽质量浓度，g/100 mL;A为游离氨基酸的质量浓度，g/100 mL。同一样品测定3次，其结果的算术平均值作为最终结果，最终结果精确到小数点后4位。

1.4.2 上清液中总蛋白质质量浓度的测定

采用凯氏定氮法测总蛋白质质量浓度。

离心：分别抽取三种水解液和蒸馏水各 3.0 mL 于4支 25 mL 离心管中，用 4000 r/min 离心机离心 10 min。随后吸取 1.0 mL 上清液于 25 mL 比色皿中，加入 3 mL 15%的单宁酸溶液，室温静置沉淀 10 min，再次用 4000 r/min 离心机离心 30 min，上清液为后续所需的不同水解方法获得的离心溶液。

消化：准确抽取上述上清液 2.0 mL 于干燥洁净的消化管中，并依次加入混合催化剂 0.5 g、10 mL 98% H2SO4，轻轻摇匀，放到消化炉上。打开消化炉使温度升至 421 ℃，开始计时消化 4 h。关闭消化炉，冷却至室温。

蒸馏、吸收与滴定：先用一个空管做空白测试，连续空蒸3个左右，预热蒸空管。将消解好的样品空白放入凯氏定氮仪中，关上安全门，等待仪器蒸馏结束，先取出消化管再拿出收集氨气的锥形瓶，之后用 0.01 mol/L 的盐酸标准液滴定，当锥形瓶里的液体溶液由蓝绿色变为微红色时即为滴定终点，记录空白滴定盐酸标准溶液消耗的体积V1。按照同样的步骤，依次将消解好的样品放入凯氏定氮仪中进行蒸馏与吸收，并记录盐酸标准溶液消耗的体积V2。

1.4.3 上清液中游离氨基酸质量浓度的测定

茚三酮法测定游离氨基酸质量浓度的原理：游离氨基酸和茚三酮的反应分两步进行，第一步是氨基酸被氧化，产生CO2、氨和醛，而水和茚三酮则被还原成还原性茚三酮;第二步是生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮和氨缩合成蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的质量浓度成正比，因此可通过用紫外可见分光光度仪测定 570 nm 下的吸光度值即可测出游离氨基酸的质量浓度。

氨基酸标准曲线的制作：取6支 25 mL 比色管，分别按照表1所示配制溶液。

表1 氨基酸标准溶液预处理

将上述6支比色管加塞密封置于沸水中加热 20 min，取出后立即用冷水冷却并摇动，使加热时形成的红色被空气氧化褪色呈现蓝紫色。将6份氨基酸标准溶液分别置于 3 cm 比色皿中，另用空白试剂做对照组，在 570 nm 波长下测定标样显色溶液吸光度。以丙氨酸标准溶液质量浓度为横坐标，以对应的丙氨酸标准溶液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1 氨基酸测定标准曲线

由以上氨基酸标准曲线得到的回归方程为y=0.023x+0.0599，相关系数R2=0.9955，因此在氨基酸质量浓度为 0～25 μg/mL 范围内呈现良好的线性关系。

上清液中游离氨基酸质量浓度的测定：准确抽取1.4.2中3种水解方法获得的离心液各 1.0 mL 于3支 25 mL 比色管中，各管中均加入 2.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL 抗坏血酸溶液和 5.0 mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，并加水定容至 25 mL，摇匀，盖塞。置于沸水浴中加热 20 min 进行显色，取下冷却。按照氨基酸标准溶液测定方法在 570 nm 波长下比色，并在氨基酸标准曲线上查出相应的游离氨基酸质量浓度。

1.5 数据处理

所有试验均重复3次，用SPSS 26.0软件分析差异显著性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同水解方法制取的蚕丝蛋白水解液多肽质量浓度

不同水解方法制取的蚕丝蛋白水解液中多肽的质量浓度如图2所示。

图2 不同水解方法对多肽质量浓度的影响

2.2 分析讨论

从SPSS数据统计分析结果可知，3种水解方法的P值均小于0.05，差异极显著，具有统计学意义。3种水解方法获得的水解蚕丝液的多肽质量浓度各不相同，其中，H2SO4水解法获得的多肽质量浓度均值为 0.5976 μg/100 mL，H3PO4水解法得到的多肽质量浓度均值为 0.1866 μg/100 mL，NaOH水解法获得的多肽质量浓度均值为 0.3786 μg/100 mL。本试验探索出采用98% H2SO4，以1∶3质量比于 95 ℃ 下反应 6 h 的水解条件是最佳的，获得的多肽质量浓度最高，其次是6% NaOH，以1∶100质量比于 60 ℃ 反应 3 h，最后是85% H3PO4，以1∶4质量比于 95 ℃ 下反应 6 h 的条件，该法获得的多肽质量浓度较低。

3 结论

本试验探索出采用质量分数98% H2SO4，以1∶3质量比于 95 ℃ 下反应 6 h 的水解条件是最佳的，获得的蚕丝蛋白水解液多肽质量浓度最高。对不同的水解方法获得的蚕丝蛋白水解液多肽含量进行研究，可为蚕丝蛋白工业化生产提供理论依据。我国蚕茧资源丰富，容易收集，价格低廉，资源丰富，占有一定的优势;其有效成分在医药、保健、护肤及食品工业有广泛的应用，市场占有率高。最终，我们希望能够拓宽蚕丝蛋白的应用领域，提升蚕丝产品的附加值，让蚕丝为人们带来可观的经济效益和社会效益。