临床分离CRKP耐药和毒力基因检测及分子进化分析

陈祖阳，徐令清，何倩君

(广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院 1. 检验医学部/输血科； 2. 检验医学部/检验科，广东 清远 511500)

肺炎克雷伯菌是一种常见的条件致病菌，容易引起医院感染，可导致呼吸系统、泌尿系统、创口及血流感染等。碳青霉烯类抗生素抗菌活性强，抗菌谱广，对宿主毒性小，对头孢菌素酶(AmpC酶)和超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)作用效果良好，在临床上越来越广泛的用于治疗重症感染患者。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类细菌检出率不断增加，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的检出率也在不断增加，多个国家和地区出现散发和(或)流行病例[1-2]。高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumonia,hvKP)常表现为高侵袭性，预后差，病死率高的特点，hvKP最早在东南亚发现，但全世界范围内报道病例越来越多，包括欧洲和美国，中国是hvKP感染的高发地区[3]。近年来耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)感染的研究报道越来越多，由于其广泛耐药，导致感染治疗缺乏可选择药物。研究[4-5]表明，CR-hvKP容易在医院环境中传播，研究临床CR-hvKP十分重要。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集某院2020年3月—2021年3月临床各科室分离的CRKP共36株，菌株入选标准：(1)CRKP，至少对碳青霉烯类药物(亚胺培南、美罗培南、厄他培南)3个药物中的一个药物耐药[亚胺培南、美罗培南最低抑菌浓度(MIC)≥4 μg/mL，厄他培南MIC≥2 μg/mL]，参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)2020年版标准。(2)多次培养出CRKP，则纳入首次培养信息。菌株于灭菌脱脂牛奶-80℃中保存。36株标本中以呼吸道标本为主，其中痰标本25株(69.44%)，尿标本5株(13.89%)，血标本5株(13.89%)，腹腔引流液1株(2.78%)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2 仪器与试剂 BD phoenix M50(美国BD)全自动细菌鉴定仪及其配套鉴定药敏卡，哥伦比亚血琼脂平板(安图)，M-H琼脂平板(江门凯林)，S1000TMPCR扩增仪(美国BIO-RAD)，Power PacTMBasic电泳仪(美国BIO-RAD)，Gel DoxTMXR+紫外凝胶成像系统(美国BIO-RAD)，高速离心机(赛默飞)，CO2培养箱(日本松下)，布鲁克质谱仪。试剂选用天根科技有限公司(TIANGEN)生产的Taq PCR MasterMix及GelRed核酸染料，北京博迈德基因技术有限公司DNA Marker II成品，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 黏液拉丝试验与药物敏感试验 菌株复苏后，分区划线接种于血平板，培养18～24 h，质谱仪重新鉴定菌种。用无菌接种环挑取单个菌落，重复3次；拉丝长度≥5 mm为拉丝试验阳性，即为高黏液型肺炎克雷伯菌(HMKP)。采用BD phoenix M50全自动微生物鉴定系统对菌株进行药物敏感试验，药敏结果判断参照2020版CLSI标准进行。

1.3.2 细菌DNA提取 95℃金属浴15 min，12 000 r/min离心5 min，提取核酸，取适量上清液(DNA提取产物)于灭菌的1.5 mL EP管中；使用核酸蛋白检测仪检测DNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值应为1.7～1.9，浓度调整为大约50 ng/μL，合格后于-80℃冰箱保存。

1.3.3 耐药基因、荚膜血清型及毒力基因检测 采用聚合酶链反应(PCR)扩增4种主要碳青霉烯酶耐药基因，包括blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48，碳青霉烯酶耐药基因引物序列见表1；扩增肺炎克雷伯菌常见荚膜血清型及毒力基因，包括荚膜多糖相关基因magA、rmpA2、wcaG，铁载体相关基因aerobactin、iutA、iroN、ybtS、ycf。菌毛编码相关基因mrkA、mrkD、fimA、fimH，毒力质粒Plvpk相关基因Plvpk、silS、terW，脂多糖表达相关基因uge。同时通过扩增wzi基因检测肺炎克雷伯菌荚膜多糖血清型，确定待测菌株的wzi分型及荚膜血清型。引物序列参考相关文献[6]，见表2。反应体系：总体积25 μL，Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 11 μL。所有PCR产物的纯化与分析均由生工生物工程(广州)股份有限公司完成，测序结果提交巴斯德网站https://bigsdb.pasteur.fr比对确定其基因型。

表1 碳青霉烯酶耐药基因引物序列及扩增产物大小Table 1 Primer sequences and size of amplified products of carbapenemase resistance gene

表2 肺炎克雷伯菌荚膜血清型及毒力基因引物序列及扩增产物大小Table 2 Primer sequences and amplified product size of Klebsiella pneumoniae capsular serotypes and virulence genes

续表2 (Table 2， Continued)

1.3.4 hvKP的判定 目前暂时没有hvKP统一的判断标准。参考相关文献[7]，本研究将同时携带rmpA/rmpA2、aerobactin、iroN基因的菌株，判定为hvKP。

1.3.5 多位点序列分型(MLST) MLST引物序列和反应条件参照http://bigsdb.Pasteur.fr，再将测序结果提交MLST数据库网站(http://bigsdb.Pasteur.fr)比对，获得等位基因编码，再将获得的等位基因编码按照gapA、infB、mdH、pgi、phoE、rpoB、tonB的顺序组合，获得相应的ST型。

1.3.6 wzi分型 将测序结果提交于MLST数据库网站中(http://bigsdb.Pasteur.fr)比对获得相应的血清型。

1.3.7 基于wzi构建分子进化树 从NCBI下载浙江菌株KP18069(GCF_014123345.1)、安徽菌株11219(GCF_003285145.1)、北京菌株H11(GCF_002761515.1)、香港菌株GD4(GCF_002893825.1)基因组数据包，找到wzi基因CDS序列，连同32株CRKPwzi基因测序结果,应用MEGA 7.0软件，经ClustalW全局对比后，构建Maximum-likelihood进化树，模型采用Kimura2-Parame-ter model，Bootstrap值设为1 000，缺失值处理为partial deletion，cutoff：70%。

2 结果

2.1 患者基本情况 36株CRKP分离自危重医学病科21株，脑科11株，呼吸内科3株，康复医学科1株。患者基本情况：36例均有深静脉置管、引流管、气管插管或气管切开操作，使用抗菌药物≥3种26例，合并诊断肺部感染18例。1例上报医院感染监控系统疑似医院感染，疑似程度86%，另有30例通过查阅医院病历系统和检验系统，呈不同程度怀疑医院感染，医院感染判断标准参照WS/T 524—2016医院感染暴发控制指南。

2.3 黏液丝试验 36株CRKP黏液丝试验均为阴性。

2.4 耐药基因、荚膜血清型及毒力基因检测结果 未检出K1、K2、K5、K20、K57五种常见荚膜血清型。

图1 36株CRKP药敏结果矩阵图Figure 1 Matrix of 36 strains of CRKP antimicrobial susceptibility results

wzi荚膜血清分型显示，32株CRKP中31株为K14.K64型，1株为K24型。耐药基因检测结果显示：36株CRKP均检出blaKPC基因，PCR扩增产物电泳结果。见图2。未检出blaIMP、blaVIM、blaOXA-48基因。毒力基因检测结果显示：36株CRKP均携带rmpA2、wcaG、ybtS、aerobactin、iutA、iroN、ycf、mrkD、mrkA、silS、uge、Plvpk、fimH基因，TerW基因检出率为86.11%，未检出magA和fimA基因。36株CRKP均携带rmpA2、iroN和aerobactin基因，判定本研究中36株CRKP均为CR-hvKP。

2.5 MLST结果 36株CRKP均为ST11型。见图3。

2.6wzi基因分子进化结果 32株CRKP中31株100%同源，1株与浙江菌株KP18069 99%同源，见图4。

注：A为blakpc基因PCR扩增产物凝胶电泳结果；B为wzi基因PCR扩增产物凝胶电泳结果；M为DNA Marker；N为阴性对照。图2 部分基因PCR扩增产物凝胶电泳结果Figure 2 Gel electrophoresis results of PCR amplification products of partial genes

图3 CRKP管家基因PCR扩增产物凝胶电泳结果Figure 3 Gel electrophoresis results of PCR amplification products of housekeeping genes

图4 CRKP wzi基因分子进化分析结果图Figure 4 Evolutionary tree based on wzi gene sequencing results

3 讨论

根据全国细菌耐药监测网2014—2019年细菌耐药性监测报告[8]结果显示，肺炎克雷伯菌在革兰阴性杆菌中检出率为13.9%～14.4%，仅次于大肠埃希菌(20.1%～21.2%)。肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药率从4.8%升至10.5%。CRKP检出率逐年上升，给抗感染治疗带来巨大挑战，控制CRKP医院传播，了解其耐药机制已成为医务人员及研究人员的关注焦点。本研究中CRKP对美罗培南、亚胺培南耐药率均为97.22%，对其他临床常见抗菌药物也呈现高度耐药。本研究中36例患者均有深静脉置管、引流管、气管插管或气管切开操作，使用抗菌药物≥3种26例，合并诊断肺部感染18例。长期入住重症监护病房(ICU)，病情危重，免疫力低下，执行侵入性操作，抗菌药物不合理使用都可能是CRKP感染的易感因素，与kiddee等[9]研究一致。本研究中痰标本占69.44%，表明CRKP可能主要定植于呼吸道，而患者频繁地通过呼吸机辅助通气时侵入呼吸道，造成进一步感染[10]。如果CRKP获得了hvKP的毒力质粒，进化为CR-hvKP，在抵抗力低下患者中传播流行，会导致病死率与治疗成本增加[11]。

本研究中36株CRKP均携带rmpA2、iroN和aerobactin基因，判定本研究中36株CRKP均为CR-hvKP。36株CRKP均携带rmpA2、wcaG、ybtS、aerobactin、iutA、iroN、ycf、mrkD、mrkA、silS、uge、Plvpk、fimH基因；TerW基因检出率为86.11%；均未检出magA和fimA基因。rmpA基因是黏液性调节因子，能有效激活荚膜的产生，使菌株表现出较高的黏液性和更强的毒力性。本研究中黏液丝试验均为阴性，但36株菌株均携带rmpA2基因。研究[12]表明，rmpA2与rmpA有80%的同一性，rmpA2通常位于毒力质粒中，rmpA/rmpA2基因可作为确定hvKP菌株的可靠生物学标志之一。magA基因编码荚膜血清型KI特异性Wzy聚合酶，只存在于K1血清型的菌株中，携带magA基因的菌株具有黏性的胞外多糖网状结构，可抗吞噬血清补体抵抗，导致进一步的侵袭性感染。本研究中36株均未携带magA基因，也未检出K1荚膜血清型。研究[13]表明，wcaG基因是肺炎克雷伯菌菌血症分离株生物膜形成的独立危险因素，wcaG编码的蛋白质参与了岩藻糖的生物合成，wcaG缺失突变会影响大部分荚膜多糖基因的表达，表明wcaG可能通过改变微生物多糖荚膜的组成促进肺炎克雷伯菌生物膜形成。36株菌株均携带rmpA2和wcaG基因，两者之间是否共同促进激活荚膜多糖的合成，进而促进生物膜的形成，还需要进一步研究。

铁的摄入对细菌的生长非常重要，Fe3+生理条件下溶解度低，难以利用，且无法直接透过细胞膜主动转运到细胞内，细菌需合成并分泌铁载体摄取铁来满足生长需求。气杆菌素、耶尔森菌素、沙门菌素、肠杆菌素是肺炎克雷伯菌中重要的四种铁载体。研究[14]表明，气杆菌素(aerobactin)是肺炎克雷伯菌主要的毒力决定因子，能显著提高肺炎克雷伯菌在人腹腔积液、血清及小鼠全身和肺部感染中的存活率，仅表达气杆菌素就能明显提高肺炎克雷伯菌毒力。本研究36株菌株均携带铁载体相关基因aerobactin、iutA、iroN、ybtS、ycf，进一步证明本研究中36株CRKP均为CR-hvKP。

黏附于宿主细胞表面是细菌感染宿主的关键一步。研究[15]表明，菌毛普遍存在于肺炎克雷伯菌，cKP与hvKP间分布并无明显差异。肺炎克雷伯菌的黏附因子主要有Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，Ⅰ型菌毛由fimA和fimH基因编码调控，fimA基因编码的蛋白质构成主要亚基，FimH蛋白是位于菌毛尖端的黏附素，主要黏附表面含有甘露糖成分的物质，如泌尿生殖道上皮细胞，促进生物膜形成，导致难治性尿路感染；Ⅲ型菌毛由mrkABCDF操纵子编码，主要由菌毛亚单位mrkA和小分子黏附素mrkD组成，mrkD促进kpn黏附不同类型的细胞，如气管上皮细胞、肾小管上皮细胞等。mrkA主要黏附于非生物材料表面，启动kpn在留置的导管上形成生物膜[16-17]。本研究中36例患者均有深静脉置管、引流管、气管插管或气管切开病史，可能是CR-hvKP定植于呼吸机表面导致医院传播。uge基因促进脂多糖的表达，研究[18-19]表明，缺乏uge基因的肺炎克雷伯菌菌株毒性较低，并且不太可能引起尿路感染、肺炎或败血症，uge基因突变降低了肺炎克雷伯菌感染尿路的毒力。

结合质粒(p17ZR-91-Vir-KPC)是由非结合Plvpk样质粒和结合blaKPC-2载体质粒融合而成，并与其他两种非融合质粒动态存在。p17ZR-91-Vir-KPC与其他敏感型肺炎克雷伯菌结合，可以使敏感型肺炎克雷伯菌快速表达碳青霉烯类耐药性和高毒力的表型[7]。毒力质粒可以从含有hvKP的结合型IncF质粒转移到大肠埃希菌中。含有毒力和IncF质粒的大肠埃希菌转导子，无论是否形成杂合质粒，都可以通过不同的方式将毒力质粒或杂合质粒进一步转移到CRKP，将hvKP中的pLVPK样非结合毒力质粒动员到CRKP和大肠埃希菌菌株中。抗菌药物的不合理使用可能会促进编码抗生素耐药性的结合质粒的转移和非结合毒力质粒的传播，导致CR-hvKP的传播[19-20]。

研究[21]表明，wzi基因检测可高效检测肺炎克雷伯菌的荚膜血清型。本研究成功测序32株CRKP的wzi基因，血清型分型K14.K64型31株，K24型1株。基于wzi基因测序结果构建分子进化树，结果显示临床分离的CRKP高度同源，32株100%同源，表明存在医院传播；另外，1株与浙江报道菌株KP18069 99%同源，通过查看病例发现8337菌株分离患者为省外务工人员，不排除有输入性传播，应引起高度重视。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。