耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌分子流行病学特征及耐药性

兰 敏,赵志军,康宇婷,王艺璇,李佳铭,刘春兰,马慧慧,贾 伟

(1. 宁夏医科大学临床医学院,宁夏 银川 750004; 2. 宁夏医科大学总医院医学实验中心,宁夏 银川 750004; 3. 宁夏病原微生物重点实验室，宁夏 银川 750004)

肠杆菌目细菌主要存在于人类肠道中，是医院和社区获得性感染的重要病原菌，可引起尿路感染、呼吸道感染和脓毒症等多种疾病。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，肠杆菌目细菌耐药率不断上升，其中耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacterales,CRE)的增加尤为明显。CRE指对亚胺培南、美罗培南、多利培南(MIC≥4 μg/mL)或厄他培南(MIC≥2 μg/mL)等任何一种碳青霉烯类药物耐药的肠杆菌目细菌，以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主，这些细菌能够产生不同种类的碳青霉烯酶，水解多种抗生素[1]。新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)自2008年在印度首次发现至今已产生33种变异体[2-4]。携带blaNDM基因的细菌被称为“超级细菌”，其出现加大了临床治疗难度，引起公众关注，给公共卫生带来极大隐患与威胁。

本研究调查宁夏医科大学总医院2018年1月—2021年5月临床分离CRE的临床分布、标本来源、耐药率、耐药基因及传播情况等，并对分离获得的大肠埃希菌耐药性及同源性进行分析,为临床患者的诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2018年1月—2021年5月宁夏某医院住院患者感染的CRE非重复菌株158株。

1.1.2 仪器与试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)，二氧化碳培养箱(HEAL FORCE)，梯度PCR仪(Eppendorf)，多色荧光凝胶成像系统(BIO-RAD)，生物安全柜(Telstar),高性能干溶器(QBD4-Grant)，药敏纸片(OXOID)，Taq2 PCR Master Mix(Takara)，DNA marker(Takara)，电泳槽(BIO-RAD)，高压水平电泳仪(BIO-RAD)，LB液体培养基(Solarbio)，MH琼脂平板(babio)。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与鉴定 采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定细菌并进行药敏试验，根据2020年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M100第30版标准筛选对亚胺培南或美罗培南耐药的肠杆菌目细菌。

1.2.2 耐药基因检测 水煮法制备细菌DNA，聚合酶链式反应(PCR)扩增超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因(blaSHV和blaTEM)和碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaOXA-48、blaNDM、blaIMP)。

PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s(30个循环)；72℃再延伸5 min。引物序列与退火温度见表1。

其中，NDM基因的PCR阳性扩增产物送上海生工生物工程公司测序，NCBI比对分析确认NDM基因亚型。

1.2.3 碳青霉烯酶表型检测 根据CLSI 2020年M100第30版标准中改良碳青霉烯灭活试验操作流程，对耐碳青霉烯类大肠埃希菌进行改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method, mCIM)联合EDTA改良碳青霉烯灭活试验(EDTA-modified carbapenem inactivation me-thod，eCIM)。

1.2.4 质粒接合试验 参考文献[5-6]的方法并对部分步骤改良：将大肠埃希菌J53AZR(受体菌)和产NDM酶的耐碳青霉烯类大肠埃希菌(供体菌)分别接种于MH琼脂平板，活化好菌株后振摇培养至一定浓度，之后将受、供体菌按4∶1的比例混合于LB液体培养基中，37℃静置过夜。16 h后取100 μL均匀涂布于含2 μg/mL美罗培南和100 mg/L叠氮钠的MH平板，CO2孵箱过夜，细菌生长即为接合试验成功。

表1 耐药基因引物序列、退火温度及扩增产物片段大小Table 1 Primer sequences, annealing temperature, and size of amplified products of drug resistance genes

1.2.5 多位点序列分型(MLST) 依据MLST网站提供的引物序列扩增耐碳青霉烯类大肠埃希菌的7对管家基因(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)，扩增产物送华大测序，在MLST网站上比对结果，获得细菌相应的ST型，使用BioNumerics 8.0软件对耐碳青霉烯类大肠埃希菌进行亲缘关系分析。

2 结果

2.1 菌株的科室分布与标本类型 共收集158株CRE，主要分离自ICU(36株，22.78%)，其次是烧伤整形科(30株，18.99%)，新生儿科(18株，11.39%)，肝胆外科(18株，11.39%)，急诊科(10株，6.33%)，血液科(5株，3.16%)和其余21个科室(共41株，25.95%)。

菌株的标本类型主要为痰(43株，27.22%)、脓性分泌物(28株，17.72%)、引流液(21株，13.29%)、无菌中段尿(17株，10.76%)和静脉血(16株，10.13%)，其余11种标本共33株(20.89%)。

2.2 菌种检出情况 158株CRE主要为肺炎克雷伯菌61株(38.61%)，其次是阴沟肠杆菌37株(23.42%)，大肠埃希菌23株(14.56%),摩氏摩根菌10株(6.33%)，奇异变形杆菌和黏质沙雷菌各9株(5.69%)，其他CRE共9株(5.69%)。

2.3 CRE药敏情况 CRE对9种抗菌药物的耐药率≥50%，对亚胺培南耐药率达100%，对美罗培南耐药率达73.13%(98/134)。见表2。

表2 CRE对抗菌药物耐药率Table 2 Antimicrobial resistance of CRE

2.4 耐药基因检测和NDM基因分型 158株CRE中4种碳青霉烯酶基因blaNDM、blaOXA-48、blaKPC和blaIMP的检出率分别为78.48%、32.28%、8.23%、5.69%。携带blaNDM基因的菌株中，携带blaNDM-1、blaNDM-5和blaNDM-9基因的菌株分别为30、92、2株。51.90%的菌株携带ESBLs基因。同时携带blaNDM基因和其他耐药基因的菌株共77株，其中29株同时携带2种耐药基因，29株同时携带3种耐药基因，11株同时携带4种耐药基因，8株同时携带5种耐药基因。见表3。

2.5 mCIM联合eCIM试验检测碳青霉烯酶表型 23株耐碳青霉烯类大肠埃希菌中22株(95.65%)产金属酶，1株(4.35%)碳青霉烯酶阴性。

2.6blaNDM水平转移情况 质粒接合试验显示，20株产NDM金属酶大肠埃希菌中共15株菌质粒成功转移，接合子经质谱鉴定为大肠埃希菌，采用PCR检测接合子blaNDM基因。K-B法药敏试验表明接合子对亚胺培南、美罗培南和头孢吡肟等具有耐药性。

2.7 大肠埃希菌MLST结果 将管家基因测序结果提交至MLST数据库比对，结果显示23株大肠埃希菌依据MLST分析共鉴定出14种ST分型，以ST10和ST410型为主，分别为5株(21.74%)、4株(17.39%)，其次为ST93(2株)和ST95(2株)，ST90、ST162、ST167、ST209、ST648、ST693、ST848、ST2705、ST6050和ST12686各检出1株。聚类分析见图1，最小生成树见图2。

表3 158株CRE耐药基因检出情况Table 3 Detection result of drug resistance genes of 158 CRE strains

注：ur为尿，bl为静脉血，se为脓性分泌物，bi为胆汁，su为引流液，sp为痰，as为脓液。图1 23株大肠埃希菌MLST聚类分析图Figure 1 MLST cluster analysis of 23 strains of Escherichia coli

图2 23株大肠埃希菌最小聚类树Figure 2 Minimum cluster tree of 23 strains of Escherichia coli

3 讨论

CRE因感染治疗难度大、病死率高、传播快和数量多等因素备受关注，其耐药问题已成为全球公共健康领域的重大挑战之一[7]。过去十年中，CRE已成为导致医院感染，尤其是ICU感染，最常见的病原体之一[8]。本研究显示，ICU和烧伤整形美容科患者是医院CRE感染的高危人群，长期住院、大量广谱抗菌药物的使用都可能是导致ICU患者CRE感染的主要原因。在本研究中，2018—2021年5月每年分别检出CRE 45株(28.48%)、15株(9.49%)、79株(50.00%)及19株(12.03%),其中肺炎克雷伯菌是主要病原体，第二、三位分别是阴沟肠杆菌和大肠埃希菌，三者占所有CRE分离株的76.58%(121/158)，与Zhang等[9]的结果一致。分离株标本来源以痰为主，其次为脓性分泌物与引流液。不同标本中检出的CRE种类有所不同，痰标本中主要为肺炎克雷伯菌，而脓性分泌物和引流液则以大肠埃希菌为主。158株CRE对亚胺培南敏感率为0，对头孢类抗生素耐药率均超过80%。

在肠杆菌目细菌中许多类型的碳青霉烯酶和ESBLs已广泛存在并传播，对公众健康造成极大威胁。CRE耐药性主要归因于产碳青霉烯酶，肠杆菌目中最常见的碳青霉烯酶基因有blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48等[10]。其中NDM金属酶属于B类β-内酰胺酶，能水解除氨曲南以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素。自2008年首次分离并报道携带blaNDM的肺炎克雷伯菌以来，迄今为止已发现33种blaNDM基因变异体[4]，分子流行病学研究发现其变异体中主要以NDM-1型金属酶为主，近年来，研究[11-15]显示，blaNDM-5在中国和印度等国家越来越常见。本研究中分离的158株CRE携带的碳青霉烯酶基因以blaNDM为主，其中blaNDM-5最多，blaNDM-1次之。研究结果表明，该院CRE中blaNDM基因的存在已非常普遍。除此之外，还首次在该地区检出产NDM-9金属酶的大肠埃希菌。2011年中国首次报道携带blaNDM-1的大肠埃希菌，随后发现耐碳青霉烯类大肠埃希菌中产NDM金属酶的菌株分离率较高[16]。本研究中的23株耐碳青霉烯类大肠埃希菌，20株检出blaNDM基因，分别为blaNDM-1、blaNDM-5和blaNDM-9。NDM-5金属酶和NDM-9金属酶在NDM-1金属酶的基础上分别通过第88位(缬氨酸→亮氨酸)和152位(甘氨酸→赖氨酸)氨基酸位点的突变，使其水解活性增强[2]。可能是由于突变的单个氨基酸会影响NDM蛋白的二级结构和三级结构,从而改变NDM与底物即β-内酰胺类抗生素的结合特性,进而表现出不同的水解能力[17]，但具体机制有待进一步研究。研究[2,18-19]表明，NDM-5酶和NDM-9酶对除氨曲南外的所有β-内酰胺类药物的酶活性均高于NDM-1酶，其对美罗培南、亚胺培南、头孢西丁和头孢噻肟的水解活性和亲和力略增高。该院NDM酶亚型逐渐变化，还应持续监测其耐药性变化，及时发现新亚型，防止某一亚型在CRE中传播与暴发。

质粒接合试验结果显示，三种类型的blaNDM基因均可通过质粒进行水平转移与传播。研究[20]发现，绝大多数blaNDM基因位于IncF、IncA/C、IncL/M、IncH、IncN和IncX3等20种不同类型的质粒上，能随着质粒的自我复制在细菌间接合转移，引起blaNDM基因快速而广泛地传播，产NDM酶的菌株愈发增多。在中国的几个地区已经发现了由携带blaNDM基因细菌引起的感染流行，表明blaNDM基因的高度可转移性和由blaNDM阳性微生物引起的感染严重性[21-23]。MLST结果表明，23株耐碳青霉烯类大肠埃希菌分别属于14种STs，其中以ST410和ST10为主要流行菌株，提示该院耐碳青霉烯类大肠埃希菌的克隆多样性。本研究中部分大肠埃希菌具有相同ST型，但其数量少，检出时间跨度大，未存在检出数显著增加的情况。此外，还发现科室分布距离远，标本类型不同，因此不满足临床感染流行的条件。但是医院仍应提高警惕，做好耐药菌的检测与监测工作，重视感染问题，合理治疗，避免造成更严重的后果。除ST209、ST693和ST12686外，多数大肠埃希菌携带blaNDM-5基因，仅ST95菌株携带blaBDN-9基因，1株ST10和ST848携带blaNDM-1基因，提示耐碳青霉烯类大肠埃希菌中NDM酶的多样性。医院应做好预防与检测工作，采取及时有效的措施，防止携带blaNDM基因的某一克隆株大肆流行。

CRE感染的发病率在世界范围内不断增加，携带blaNDM基因的细菌更是被称为“超级细菌”，因此医务人员应积极做好手卫生防止交叉感染，医院应加强感染防控措施的施行，严格执行医护人员与患者的卫生措施，做好消毒及防护管理[24]。同时，应对CRE和blaNDM基因进行监测，并采取有效的感染防控措施，给感染患者提供适当有效的治疗，以减缓各种CRE的流行和扩散。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。