体外诱导耳蜗毛细胞研究进展

徐正燕 郭维维

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部；国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心；聋病教育部重点实验室；聋病防治北京市重点实验室（北京 100853）

耳蜗毛细胞（hair cells，HCs）是听觉系统的机械感受器，其损伤是人类听力损失的常见原因，强噪音、耳毒性药物、衰老和遗传因素均可引起耳蜗HCs的损伤。鸟类等非哺乳类脊椎动物的HCs和斑马鱼侧线的HCs在损伤后可以自发进行修复[1]，但是在成年哺乳动物中，HCs不再具备再生能力，损伤后不能自发再生，会造成永久性的听力损失。目前临床上治疗方法主要是助听器和人工耳蜗，但是并不能从根本上解决问题。HCs再生的细胞疗法成为最具前景的研究课题和治疗方法，体外诱导获取HCs可以为临床研究和药物筛选提供细胞模型，并且为外源性细胞移植提供细胞来源。

干细胞因其具有自我更新、多向分化的特点，成为研究的热点，经过对干细胞及其治疗潜力的深入研究，使HCs再生成为可能。为了获得再生的HCs，研究者们尝试将干细胞向HCs诱导分化，目前采用较多的是将胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs），经过多年的研究，干细胞在诱导分化获得HCs方面取得了一定的进展，同时也存在一些问题。

研究者们也在尝试通过诱导体细胞获得目的细胞，Vierbuchen等[2]首先报道了在小鼠成纤维细胞中导入转录因子Ascl1、Brn2、Mytl1，将成纤维细胞重编程为神经元样细胞，此后，此方法也用于成纤维细胞向胰岛β细胞[3]、造血细胞[4]和心肌细胞[5]等的诱导。近几年，听力学研究者也在尝试诱导成纤维细胞获得HCs，为听力损伤细胞治疗寻求更加安全的细胞来源。

在这篇综述中，我们介绍了ESCs、iPSCs、MSCs以及成纤维细胞体外诱导获得耳蜗HCs的进展和存在的问题，了解HCs再生的研究进展及细胞治疗听力损失的未来前景，给耳科学医生和研究人员提供参考。

1 干细胞体外诱导

1.1 胚胎干细胞（ESCs）

Heller等[6]通过诱导ESCs获得祖细胞然后向HCs逐步分化的方法获得毛细胞样细胞（Hair celllike cells,HCLs），他们将小鼠ESCs来源的胚状体放在含有表皮生长因子（EGF）、类胰岛素1号生长因子（IGF-1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组合的无血清培养基中连续培养，产生表达Nestin和Pax2等耳祖细胞标志物的细胞，为了使得到的祖细胞进一步分化，去除培养基中的生长因子继续培养，Nestin、Pax2下调，分化的细胞表达HCs相关标记物(Math1、myosin VIIa、Espin、Brn3.1和 AchR α9)，并且有静纤毛形成，说明通过此方法可以诱导ESCs获得HCLs，但是该方法耗时很长且方法较为复杂。之后，heller实验组[7]又进一步改良培养方案试图诱导小鼠ESCs获得HCs，他们通过添加IGF-1促进前外胚层的形成，同时加入Dkk1（Wnt信号抑制剂）、SIS3（Smad3抑制剂）和 bFGF，刺激ESCs向耳祖细胞分化，最终获得表达HCs标记物myosin VIIa的细胞，然而，诱导细胞没有呈现典型的HCs形态，也没有检测到纤毛束标记物，之后研究者发现诱导的细胞放在灭活的有丝分裂鸡囊基质细胞层上培养时可以观察到立体纤毛束，对机械刺激的反应方式与未成熟HCs相似，实验证实了ESCs可以诱导获得具有功能性的HCLs，但是诱导效率很低，只有1%-2%，且培养方式局限，只能在有丝分裂的鸡囊基质细胞层上进行。之后Heller的研究小组[8]又将他们的研究扩展到人ESCs，他们将之前的诱导分化方案[7]进行修改应用到人ESCs的诱导中，获得表达多种HCs标记物组合的细胞，这些细胞类似于新生的HCs，但是数量很低，而且没有通过增加培养时间进一步成熟，最后死亡了，说明对于人源ESCs的诱导仍需进一步研究。

也有研究者通过模拟内耳HCs的体内发育过程运用3D培养的方式诱导获得HCs。Koehler等[9]通过3D培养小鼠ESCs使其向内耳感觉上皮分化，实验通过精确控制骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGFβ)和成纤维细胞生长因子（FGF）信号的时间来重现HCs的体内发育，产生的细胞带有立体纤毛束，具有HCs机械敏感的功能特性，并能与培养物中ESCs产生的感觉神经元形成特殊的突触。类似的，Jing Nie等[10]通过将小鼠ESCs 3D培养，先是获得内耳感觉上皮细胞，然后通过模拟体内内耳发育过程中关键信号通路的激活和抑制，依次用重组蛋白和小分子抑制剂处理ESCs，以激活或抑制 BMP、TGFβ、FGF 和 Wnt信号通路，使ESCs最终分化为含有感觉上皮的HCLs。

此外，Ouji等[11]结合他们以前报道的Math1转染[12]和ST2基质细胞条件培养基[13]的方法诱导小鼠ESCs向HCs分化，获得了高达30%的表达HCs标记物的细胞，并且具有明显的立体纤毛样结构，大大提高了诱导效率。

1.2 诱导多能干细胞（iPSCs）

iPSCs具有与ESCs相似的特性，避免了ESCs的伦理问题，成为多能干细胞研究的热点。Oshima等[7]用表达Oct4、Sox2、Klf4和cMyc的逆转录病毒感染Math1/nGFP胚胎成纤维细胞获得iPSCs，并用同样的方法诱导ESCs和制备的iPSCs向HCs分化，实现了iPSCs向HCLs的诱导分化，并且他们发现ESCs和iPSCs沿耳系分化能力方面和获得的HCLs功能方面没有显著差异，但是培养方式的局限同样限制了其应用。之后，Ohnishi H等[14]通过模拟内耳发育的过程，将人源iPSCs依次转化为胎盘前外胚层、耳基板和HCLs。他们分三步进行诱导，首先将人源iPSCs接种在基质包被的培养皿上并加入N2/B27的无血清培养基培养8天进行胎盘前外胚层的诱导，经诱导后90%以上的细胞表达了胎盘前外胚层相关的基因；然后加入bFGF使经胎盘前外胚层诱导后的细胞向耳基板样细胞分化，获得了数量有限的耳基板标记阳性的细胞；最后将前两步获得的细胞在含基底膜的无血清培养基中培养48天，产生了HCLs，其表达HCs标记物（myosin VIIa）并有静纤毛束状结构，为体外诱导获取HCs提供了一个较简便的方法，但是诱导细胞数量有限，myosin VIIa阳性细胞的比率仅占0.01±0.008%。

同样的，3D培养方案也应用于iPSCs诱导中。Jeong M等[15]通过3D培养诱导人类iPSCs产生耳部类器官，其中前庭HCs和耳蜗HCs都带有机械感觉离子通道的静纤毛束状结构。同时，Nie J等[16]通过人源iPSCs放于低粘附的96孔板中进行3D培养，开始用细胞外基质蛋白处理促进其上皮化，然后模拟内耳发育过程中信号通路的激活和抑制，用小分子和重组蛋白调节BMP、FGF和WNT等信号通路，逐步诱导耳基板的形成，随后形成耳囊泡，最终获得包含HCs和支持细胞的感觉上皮，以及与HCs形成突触的神经元。

1.3 间充质干细胞（MSCs）

MSCs来源于巨核细胞系，最早由Friedenstein等分离获得[17]，来源广泛，存在于骨髓、脂肪、脐带等部位，且具有低免疫原性、低致瘤性和分裂增殖能力强等优点，被研究者广泛采用。研究发现IGF-1是一个强大的内耳分裂源，可以促进内耳细胞的分裂[18]。He Qin等[19]首先通过向培养基中加入N2/B27、EGF和bFGF等诱导获得神经干细胞，然后加入EGF、IGF-1和N2/B27的无血清培养基中诱导分化，最后获得的细胞形态与耳蜗HCs相似，且可以表达HCs的标记物myosin VIIa。江红群等[20]运用耳蜗Corti器与MSCs共培养的方法体外诱导获得HCs，他们将分离出生1-3天的乳鼠耳蜗Corti器与分离培养的大鼠MSCs体外共培养14天，经鉴定，诱导分化的细胞可表达HCs的标志物myosin VIIa和math1。Mahmoudian-Sani MR 等[21]尝试用人骨髓MSCs诱导分化，他们在培养液中加入维甲酸（RA）、bFGF和EGF，发现诱导细胞在mRNA水平上ATOH1、SOX2和POU4F3标记物的表达增加，蛋白水平上ATOH1表达增加，但是形态并未发生改变。也有研究者运用脐带MSCs体外诱导获取HCs，张婷等[22]通过体外诱导人脐带MSCs向神经干细胞分化再向HCs分化的方法，获得表达HCs标记物myosin VIIa、Brn3c、Aoth1的细胞。

2 成纤维细胞

近几年研究者开始尝试用成纤维细胞诱导获得HCs，为临床治疗及基础研究提供更加安全的细胞来源。

有研究者尝试将小鼠胚胎成纤维细胞体外诱导获得HCs。Yang Q等[23]通过间质上皮转化逐步诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为HCLs，他们首先通过TGF-β抑制剂SB431542诱导小鼠胚胎成纤维细胞间质上皮转化，然后通过过表达三个关键转录因子（Sox2,Eya1和Six1）使其获得耳部感觉上皮细胞特性。这些诱导的HCLs表达多种HCs特异性蛋白，有纤毛束结构，对电压刺激有反应，形成功能机械转导通道，并显示HCs特征的转录谱。他们提供了一种新的体外产生功能性HCs的方法，这可能对HCs的发育研究、药物筛选和听力损失的细胞替代治疗研究具有重要的意义。Louise Menendez等[24]报道了用四种转录因子Six1,Atoh1,Pou4f3和Gfi1（SAPG）的结合，除小鼠胚胎成纤维细胞外，还将成年小鼠尾尖成纤维细胞和出生后小鼠的支持细胞诱导为HCLs。在高含量表型筛选系统中，诱导细胞表现出HCs样形态、转录组和表观遗传特征、电生理特性、机械感觉通道表达和对耳毒素的易感性。Meng Zhao等[25]通过细胞激活和信号定向的方法，将转基因小鼠成纤维细胞直接重编程获得一种大量表达HCs标记物的细胞，在这一谱系转换过程中经历了中间祖细胞阶段。遗憾的是，这些重编程细胞仍然缺乏HCs的一些关键特征，如机械敏感离子通道，说明重编程细胞尚未获得HCs的功能特性，但是为用人体大量存在的成纤维细胞诱导获得HCs提供了一个新的研究思路。

同时也有研究者对人成纤维细胞进行体外诱导以获得HCLs。Duran等[26]通过对人类成纤维细胞过表达HCs发育中起关键作用的三个基因GFI1,POU4F3和ATOH1(GPA)获得了表达HCs标记物（MYOSIN VIIA和ESPIN）的细胞，免疫细胞化学、qPCR和RNAseq分析表明诱导细胞中有典型HCs基因的表达。他们的方法经过证明比ESCs和iPSC的方法快得多，并验证了GPA作为一组基因的组合，其激活可以使人类体细胞向HCs谱系直接转化。遗憾的是未观察到细胞极化和立体纤毛样突起的形成。

3 体外诱导耳蜗HCs存在的问题

目前已经证明通过将小鼠和人类来源的ESCs逐步分化诱导可以在体外生成耳蜗HCs，但是ESCs的伦理问题和致瘤性等问题，大大限制了其临床应用。iPSC虽然避免了ESCs的伦理问题，但是目前技术制备的iPSC的致瘤性和效率低等问题，限制了其临床应用。MSCs被认为是最有潜力的细胞来源，但是目前体外诱导获得的细胞只是表达HCs相关标记物，但诱导细胞电生理方面仍有不足，尚不能获得成熟的HCs。人体内存在大量的成纤维细胞，可以提供丰富的细胞来源，而且运用自体成纤维细胞诱导获得的HCs避免了免疫原性的问题，进行细胞治疗更加安全，直接重编程成纤维细胞获取HCs的方法为听力损伤修复研究提供了一个新的思路，但是目前利用成纤维细胞进行重编程获得HCs的研究还很少，用人类成纤维细胞重编程获得HCs的研究只搜到1篇，重编程的方法还是局限于转录因子方面，诱导效率低，诱导细胞不成熟，且不能避免潜在致瘤性的风险。

4 展望

为了获得再生的耳蜗HCs，研究者致力于干细胞分化的研究，并且取得了很多成果，但由于ESCs的伦理问题和iPSCs的潜在致瘤性，大大限制了其临床应用，MSCs在诱导效率和细胞成熟度方面仍需改进。近几年研究者开始尝试用成纤维细胞诱导获得HCs，取得了一些进展，且成纤维细胞比较丰富，用自体成纤维细胞获得HCs还可以避免免疫原性的问题，为HCs的再生提供的新的研究方向，有望成为修复受损HCs的新方法。但仍然存在一些问题，运用转录因子获得毛细胞依然具有致瘤性的风险，且目前制备的HCs功能仍不完善，编程效率低，研究者应寻求更加完善的诱导方案，获得更加成熟的HCs。已有研究者通过小分子化合物的方法诱导获得心肌细胞[27]，研究者也可以尝试用小分子化合物诱导成纤维细胞获得HCs，这将为耳损伤的研究提供更加安全的细胞来源。此外，药物筛选细胞移植都需要大量的细胞，当前体外诱导获取HCs的效率还很低，而且目前没有研究表明外源细胞可以成功取代受损的HCs恢复听觉功能，这可能是由于外源细胞很难整合进宿主细胞[28]。对于重编程的机制问题、细胞移植问题及移植后细胞存活时间问题等仍需进一步研究。