内皮间质转化在肾纤维化中的作用及机制研究进展

张小燕，王若楠，孙嘉星，丰星星，梁 亮，韩 骅，刘晓渭，晏贤春

(空军军医大学： 1西京医院肾脏内科， 2基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 3肿瘤生物学国家重点实验室， 4西京医院眼科，陕西 西安 710032)

近年来，随着糖尿病、高血压、肥胖等疾病的发病率日益增加，慢性肾脏病(chronic kidney diseases，CKD)的发病率也随之逐年上升，已成为威胁公共健康的全球性疾病之一，患病率可达13.4%[1]。CKD是多种肾脏疾病的临床统称，疾病后期可演变为终末期肾衰竭和尿毒症，甚至导致患者死亡。在此过程中，肌成纤维细胞在促纤维化因子的作用下显著活化并产生大量病理性细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。ECM异常沉积可破坏肾组织正常结构，促进纤维瘢痕形成，进而导致肾脏结构和功能发生不可逆性损伤。研究显示，肾组织中肌成纤维细胞的来源主要有组织定居的成纤维细胞、骨髓来源的纤维细胞和单核-巨噬细胞、肾小管上皮细胞、内皮细胞(endothelial cells，ECs)以及周细胞等[2-4]，其中ECs在多种外界因子及信号通路的作用下发生内皮-间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)，是肌成纤维细胞的重要来源。此外，EndMT可引起血管结构功能异常，加重组织内缺氧，可进一步导致肾组织其他类型细胞结构功能异常，是加重肾纤维化进展的重要因素。研究表明，靶向阻断EndMT过程可显著延缓肾纤维化进程，而深入了解EndMT的调控机制是治疗相关疾病的前提。因此，本文将对EndMT在肾纤维化中的作用及其调控机制的研究进展进行阐述。

1 EndMT是肾纤维化进展的重要因素

1.1 EndMT的基本概念

ECs的命运和功能具有高度可塑性，其在多种外界因素作用下可发生类似上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)样的转变，即EndMT。在该过程中，ECs间连接减弱，细胞极性丢失，细胞形态由鹅卵石样转变为纺锤样，其迁移、侵袭以及分泌能力增强。此外，ECs特征性基因如VE-cadherin、CD31、Tie1、Tie2和vonWillebrand因子等表达水平显著降低，而间质细胞特征性基因如α-SMA、Fsp-1、N-cadherin、SM22α、fibronectin、vimentin、Pdgfrβ和CD73等表达水平显著上升[5-8]。研究表明，EndMT在多种组织器官发育中发挥重要作用，如在胚胎时期参与心脏瓣膜和隔膜形成，阻断该过程可导致心脏发育异常。在成年个体中，EndMT被发现参与调控肿瘤、动脉粥样硬化以及肺动脉高压等多种疾病进展，如在肿瘤中，ECs可通过EndMT转变为肿瘤相关成纤维细胞，发挥促进肿瘤生长、转移的作用。

1.2 EndMT参与调控肾纤维化进展

前期研究表明，ECs可通过EndMT直接转变为肌成纤维细胞，进而分泌大量ECM加速肾纤维化进程。ZEISBERG等[5]利用三种不同的肾纤维化模型结合ECs特异性遗传示踪小鼠(Tie2-Cre; R26R-stop-EYFP)首次发现纤维化的肾组织中有40%～50%的成纤维细胞同时表达成纤维细胞(Fsp1和α-SMA)和ECs(CD31)标志基因，提示ECs是肾纤维化过程中肌成纤维细胞的重要来源。随后，LI等[9]利用ECs特异性遗传示踪小鼠结合共聚焦显微镜同样发现约有10.4%～23.5%的肌成纤维细胞来源于ECs， 进一步证实ECs可通过直接转变为肌成纤维细胞而促进肾纤维化进程。然而，近期的一项单细胞测序研究显示，在人和小鼠CKD疾病中，肌成纤维细胞主要来源于特定的血管周细胞以及成纤维细胞亚群，而ECs、肾小管上皮细胞等来源的肌成纤维细胞占比较低。此外，与周细胞分泌的ECM量相比，ECs来源的ECM较少，表明ECs通过转变成肌成纤维细胞进而分泌ECM调控肾纤维化进展[4]，但此种说法仍然需要进一步证实。

EndMT除了引起ECs命运发生改变以外，更关键的是导致ECs结构和功能发生异常改变[10]。在EndMT过程中，ECs中多种细胞间连接分子如VE-cadherin、ZO-1等表达下降，引起血管通透性增强、渗漏增加，血液灌流能力减弱，从而加重组织缺氧[7,10-11]，引发细胞大量死亡，破坏肾脏组织结构，最终导致肾功能衰竭。在此过程中，ECs可分泌大量炎性因子如IL-6、TNF-α、IL-1β，引起免疫细胞浸润，局部免疫应答加重，进一步促进纤维化进展[7]。此外，EndMT来源细胞因子可直接作用于肾小管上皮细胞，进而调控肾纤维化进程。近期研究显示，EndMT来源上清可诱导肾小管上皮细胞发生间质样转化，阻断EndMT可进一步减轻肾小管上皮细胞间质样转变，减缓肾纤维化进程，表明EndMT过程中EC分泌能力改变是其加重纤维化进程的重要原因[12]。

近期，LOVISA等[7]用Rosa26-LSL-EYFP遗传修饰小鼠进行谱系追踪实验，进一步证实小鼠肾纤维化进程中存在EndMT，特异性敲除调控EndMT的关键调控转录因子Snail1和Twist1可有效抑制肾纤维化中EndMT转变，减少胶原沉积，改善组织缺氧，进而有效维持肾小管上皮细胞的结构和功能，改善肾纤维化进程。以上研究表明抑制EndMT是治疗肾纤维化等疾病的重要策略，对于其调控信号通路及下游分子的研究具有重要的理论意义和临床价值。

2 多种信号通路及分子参与调控EndMT影响肾纤维化进展

ECs接受外界刺激后可活化或抑制细胞内的多种信号通路及分子，进而产生增殖、迁移以及命运转变等多种生物学行为，参与调控肾纤维化等疾病进程。已有研究表明转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、Notch、Wnt信号通路，缺氧以及细胞内的miRNAs在调控EndMT影响肾纤维化中发挥了关键作用，本部分内容将逐一对这些信号通路及分子的作用及机制进行介绍。

2.1 TGF-β信号通路

TGF-β属于转化生长因子多功能超蛋白家族成员之一。在肾纤维化过程中，肾小管上皮、间质细胞及ECs来源的TGF-β与成纤维细胞等细胞表面的TGFR2结合，活化下游的Smad信号通路，激活肌成纤维细胞及ECM的分泌，影响肾纤维化进程[5]。体内、外研究表明TGF-β信号通路可通过上调Snail1和Slug等EndMT相关分子水平进而抑制ECs标志分子，如CD31及VE-cadherin的表达，同时上调间质样标志物如SM22α、α-SMA等的表达，促进EndMT及肾纤维化进展[7,13-14]。TGF-β/Smads信号通路是调控肾纤维化的中枢信号通路，将其阻断可抑制EMT和EndMT，延缓纤维化[13-15]。特异性敲除ECs中的TGFR2可下调下游Smad2及Smad3信号通路，能够在抑制EndMT的同时改善血液灌流及组织缺氧[15]。此外，Smad2的条件性敲除可显著抑制肾小管上皮细胞样改变及成纤维细胞标志物的表达，从而减轻肾纤维化程度[16]。近期研究显示，敲除ECs中Sirt3可导致EndMT发生，进而分泌IL-1β等细胞因子，活化肾小管上皮细胞中TGF-β/Smad3信号通路，促进肾小管上皮细胞间质样转变，加重肾纤维化进程[12]。体内给予Smad3抑制剂SIS3抑制Smad3磷酸化可以阻断EndMT发生，显著减轻糖尿病性肾病和梗阻性肾病引起的肾纤维化进程[17]。

以上研究表明，阻断TGF-β信号通路可用于治疗纤维化相关疾病。目前，已有中和抗体、反义寡脱氧核苷酸以及小分子抑制剂等多种药物靶向抑制TGF-β信号通路的药物用于治疗肾纤维化。吡非尼酮是TGF-β信号通路的小分子抑制剂，可有效改善肾小球过滤率和间质纤维化，缓解糖尿病性肾病及肾小球硬化症[18]。钙核糖核酸是直接靶向TGF-β信号通路的天然抗体，研究显示该抗体可用于改善单侧输尿管梗阻和糖尿病性肾病导致的肾纤维化[19]。VOELKER等[20]利用人源化抗TGF-β1中和抗体治疗2型糖尿病性肾病的临床试验结果显示阻断该通路对缓解糖尿病性肾病的进程无明显疗效，并未明显改善蛋白尿、肾小球过滤率以及血清肌酸酐等指标。目前TGF-β信号通路抑制剂的作用广泛，但这些抑制剂有较强的副作用，表现为治疗的同时产生消除抗炎和抗肿瘤的效应，致使该治疗策略在临床研究中仍存在较大争议。因此，靶向TGF-β信号通路治疗肾纤维化相关疾病仍需要更加谨慎且细致的评估。

2.2 Notch信号通路

Notch信号通路主要介导相邻细胞间相互作用，哺乳动物中有4种Notch受体(Notch1，Notch2，Notch3，Notch4)和5种配体(Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4和Jagged1，Jagged2)[8,21]。研究表明，Notch信号可通过调控EndMT进而影响组织发育及疾病进展，如在心脏发育中，Notch信号通路缺失阻止ECs发生EndMT，可引起心脏瓣膜形成异常[22]。在肾纤维化中，肾小管上皮细胞中Notch信号通路相关的受体、配体以及下游靶基因表达水平显著上调。活化的Notch信号通路一方面促进肾小管上皮细胞发生EMT，另一方面通过促进肾小管上皮细胞分泌多种细胞因子促进炎症浸润以及肌成纤维细胞活化。此外，Notch信号通路活化可激活肾小球系膜细胞中TGF-β/Smad信号通路，促进肾纤维化进展[23]。特异性阻断肾小管上皮细胞中Notch信号通路以及使用γ-分泌酶抑制剂全身性阻断Notch信号通路可显著降低肾纤维化程度，缓解疾病进程[24]。在ECs中，WANG等[25]发现尿毒症小鼠肾脏ECs中Notch信号通路明显活化，同时表达间质标志物Fsp-1和α-SMA的ECs显著增加，EndMT增强。特异性敲除ECs中RBP-J阻断Notch信号通路显著改善肾脏血管结构、功能以及炎症细胞浸润，进而缓解尿毒症进程，提示Notch信号通路可通过调控EndMT影响肾纤维化进展[25]。近期，ZHAO等[26]发现基质金属蛋白酶9可通过上调ECs中的Notch信号通路，促进EndMT进而加重肾纤维化进程，阻断ECs中Notch信号通路可抑制基质金属蛋白酶9引起的EndMT[26]。目前，ECs中的Notch信号通路是否通过影响EndMT参与调控肾纤维化进展仍缺少直接的遗传学证据，寻找Notch信号通路天然拮抗剂仍需要更加深入的探究。

2.3 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt信号通路由一组高度保守、分泌型的信号糖蛋白组成，通过调控炎症、纤维化、血管生成和胰岛素分泌等多种方式参与肾脏的损伤和修复。哺乳动物中共有19种Wnt蛋白，其中有16种Wnt蛋白参与调控不同损伤类型的肾脏疾病[27]。在正常成人肾脏中Wnt/β-catenin信号通路活化较弱[28]，然而，在短期急性肾损伤中，Wnt信号通路会被激活，进而促进肾组织再生和修复，但是过量以及持续的信号通路活化会导致肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone, RAAS)的不可逆激活、炎症反应和细胞外基质沉积，发挥相反的作用[29]。研究表明，Wnt信号通路的大部分配体在纤维化肾的小管上皮细胞中表达，包括Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt9b和Wnt10b等[30]，其他细胞类型中也有少量表达。在高糖以及STZ诱导的糖尿病性肾病模型中，Wnt蛋白及其下游β-catenin表达水平显著升高，相反，给予胰岛素降低血糖浓度可抑制Wnt信号通路活化，表明Wnt信号通路参与调控肾纤维化相关疾病[31]。Wnt配体结合肾小管上皮细胞以及ECs膜表面受体后，促进β-catenin入核并上调Snail1和Twist等EMT及EndMT相关基因表达[31]，促进纤维化进展。在多种CKD动物模型中体内注射Wnt/β-catenin信号通路或低密度脂蛋白相关受体抑制剂阻断Wnt/β-catenin信号通路，可以抑制纤维化相关基因的表达，减少肾脏损伤部位fibronectin以及α-SMA的表达，延缓肾纤维化进程。近期，WANG等[32]报道Wnt/β-catenin介导LncRNA MALAT1参与动脉粥样硬化中的EndMT过程，过表达miR-222靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制EndMT过程，表明阻断Wnt信号通路可缓解EndMT相关疾病。KUANG等[33]报道靶向抑制miR-21或选择性抑制Wnt/β-catenin信号通路，可通过恢复肾功能和减轻肾纤维化，减轻CKD的转归和进展。靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路已成为临床上治疗肾纤维化等相关疾病的重要潜在靶点[31]。研究表明，外源性Wnt抑制剂ICG-001能减少蛋白尿、血肌酐和血尿素氮，抑制肾组织纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和β-catenin的积累，抑制其下游靶基因RAAS等表达，抑制炎症，可有效改善肾纤维化进程[34]。目前，Wnt信号通路通过调控EndMT影响肾纤维化进程仍缺乏直接的遗传证据，未来应利用细胞特异性遗传修饰小鼠结合单细胞测序等高通量手段对Wnt信号通路的作用靶点及机制进行更加深入的研究，以期更好地解析Wnt信号通路在肾纤维化过程中的细胞和分子机制，为未来开发针对该通路的治疗策略提供理论和实验依据。

2.4 微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)

miRNAs是一类高度保守的小非编码RNA，长度约为22个核苷酸，主要通过结合靶基因mRNA的3′端非编码区进而抑制靶基因翻译，导致靶基因蛋白水平下降，进而调控细胞增殖、迁移和凋亡等多种生物学过程。目前，已有多种miRNAs被发现参与调控EndMT影响肾纤维化等疾病进程[35]。GHOSH等[36]利用miRNAs阵列分析发现TGF-β信号通路诱导EndMT过程中伴随多种miRNAs表达水平的改变，如miR-125b、miR-30、miR-let-7c、miR-let-7g、miR-21、miR-30b以及miR-195等表达水平显著升高；相反，miR-122a、miR-127、miR-196以及miR-375等的表达水平明显下调。随后的研究证实miRNAs可通过调控EndMT进而影响肾纤维化进程，如miR-29家族直接靶向抑制TGF-β信号通路下游分子Smad3表达水平，进而阻断TGF-β信号通路活化，抑制EndMT和EMT过程[37]，体内递送miR-29模拟物可有效缓解肾纤维化进程。尾静脉注射含有miR-146s的聚乙烯亚胺纳米颗粒至UUO肾纤维化小鼠体内，可通过抑制TGF-β1和NF-κB信号通路活化进而减少肾纤维化[38]。近期，JORDAN等[39]发现miR-126-3p在EndMT以及肾纤维化过程中表达降低，miR-126-3p过表达抑制EndMT，提示miR-126-3p可作为治疗EndMT相关纤维化疾病的靶点。我们课题组前期研究也发现，Notch信号下游的miR-342-5p可通过靶向抑制Endglin蛋白翻译进而调控TGF-β信号下游Smad通路促进EndMT，表现为ECs中间质样标志基因α-SMA、Vimentin等表达显著上调，而ECs标志基因CD31、VE-cadherin等表达显著下调[40]。

尽管多数miRNAs与CKD疾病间的细胞与分子相关机制仍需要进一步深入阐明，但其作为肾脏疾病的治疗靶点和生物标志物已得到越来越多关注。近年来，已有多种miRNAs相关药物正在或即将进行临床试验。如以miR-21为靶点的药物RG-102(anti-miR-21)已经进入二期临床试验。RG-102由Regulas Therapeutics公司开发，主要用于Alport肾病的治疗。此外，以miR-29模拟物为基础开发的miRNA药物Remlarsen也已进入临床试验阶段，并且有望成为治疗肾纤维化等疾病的重要手段[41]。此外，与miRNAs相关药物在肾脏领域获得极大关注，如DPP-4抑制剂利格列汀可通过诱导miR-29抑制EndMT，同时减轻与DPP-4相关的糖尿病肾纤维化[42]。miRNAs除了作为治疗靶点应用于临床以外，还具备稳定性强、灵敏度高以及易检测等优点，可作为生物标志物用于疾病诊断。前期研究发现，miR-150-5p在IgA肾病患者尿液中表达显著高于健康对照组，提示该miRNA可作为IgA肾病的早期诊断指标以及治疗靶点[43]。近期，DONDERSKI等[44]利用实时定量PCR技术检测了45例CKD患者以及17例健康对照人员的尿液和血液中miRNAs表达情况，结果显示miR-29-5p、miR-21-5p以及miR-196a-5p等在CKD患者中表达显著升高，而miR-155-5p、miR-214-5p、miR-200a-5p以及miR-93-5p等在CKD患者尿液和血液中表达显著降低，提示这些miRNAs可作为CKD潜在的诊断指标。随着脂质体或纳米颗粒等新载体药物递送系统以及高通量检测技术的不断革新，未来以miRNAs作为肾纤维化等疾病的治疗靶点和生物标志物将越来越多地被应用于临床。

3 结语

越来越多的研究表明，ECs在多种因素作用下可发生EndMT进而通过多种方式调控肾纤维化等疾病进程，阻断EndMT可有效缓解疾病进展，是治疗纤维化相关疾病的重要靶点，因此，对其调控机制的研究至关重要。前期研究显示，除了本文介绍的TGF-β、Notch、Wnt以及miRNAs等信号通路外，还有MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT以及lncRNA等多种信号通路和分子调控EndMT影响肾纤维化进程[31]，这些信号通路及分子间存在相互调控共同维持肾脏等组织器官稳态，如本课题组前期发现Notch信号通路一方面可通过下游miR-342-5p调控ECs中TGF-β信号通路，另一方面还可调控ECs中Wnt蛋白表达和分泌，进而影响组织微环境稳态。随着单细胞组学技术以及其他高通量手段的广泛应用，未来探究ECs命运和功能可塑性在肾纤维化等疾病中的作用及机制将会越来越细致化，进而为肾脏疾病的临床治疗提供更加可行的策略和靶点。