超高效液相色谱-串联质谱测定鸡蛋中4 种氟喹诺酮类药物残留的不确定度评价

杨彦宁，周 灿，欧海军，隆雪明，范嘉娜，张 港，陈福华

（湖南省兽药饲料监察所，湖南 长沙 410012）

近年来，随着人们对食品安全越来越多的关注，农产品质量安全成为食品安全、人民健康、社会稳定的重要保障。根据农业农村部近期公布的农产品质量安全例行监测数据信息结合湖南省兽药饲料监察所近年来对畜禽产品检测结果分析，畜产品中禽蛋的合格率居畜禽产品最低，其中禽蛋中药物残留超标较为严重的有氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类禁用药物。

喹诺酮类（quinolones）药物是一类化学合成的抗菌药物，而氟喹诺酮类药物属于第三代喹诺酮类药物，具有广谱、高效、低毒、无交叉耐药性等特点，成为兽医临床上治疗各种感染性疾病的常用药物[1]。但随着氟喹诺酮类药物长期、低水平的接触产生各种慢性蓄积毒性，加上不合理用药和滥用药，造成动物体内存在药物残留，如果长期食用有药物残留的动物食品，会损害人类的健康[2-4]。而诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星以及洛美沙星等4 种氟喹诺酮药物由于会对养殖业、人体健康及公共安全造成危害或者存在潜在风险，在GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中已明确规定禁止使用，在禽蛋中不得检出[5]。因此，禽蛋中氟喹诺酮类药物残留检测结果的准确性在保障动物源性食品安全和公共卫生安全，确保养殖环节依法、科学、合理用药，为兽药执法监管工作的有效开展提供有力的支撑时显得尤为重要。

本文采用高效液相色谱-串联质谱测定禽蛋中4 种禁用氟喹诺酮类药物[6-13]，采用JJF-1059-2012《测量不确定度评定与表示》[14]、JJF1135-2005《化学分析测量不确定评定》[15]、CNASGL006-2019《化学分析中不确定度评估指南》[16]等对其结果进行不确定度评估，对不确定度各分量进行计算，找出影响检测结果不确定度的各种影响因素，为评定检测结果的准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

高效液相色谱-串联质谱（ABI4500Q Trap，上海SCIEX 分析仪器贸易有限公司），ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm 1.7µm，waters），诺氟沙星（97.2 %，Dr.Ehrensorfer）、培氟沙星（99.6 %，Dr.Ehrensorfer）、氧氟沙星（99.3 %，Dr.Ehrensorfer）、洛美沙星对照品（99.4 %，Dr.Ehrensorfer），C18固相萃取柱（100 mg/3 ml，安捷伦），甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯，默克）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 准确称取 2.0 g（精确至0.01 g）均质的鸡蛋样品于50 ml 离心管中，加入10 ml 1%乙酸乙腈，涡旋提取2 min，10 000r/m离心5 min，上清液转入另一50 ml 离心管中。重复提取一次，离心后合并上清液，加入20 ml 正己烷，涡旋混合1 min，10 000 r/m 离心1 min，移去正己烷，40 ℃ 水浴旋蒸至干，用2 ml 磷酸盐缓冲液溶解残渣，待净化。C18 固相萃取柱（100 mg/3 ml），分别用2 ml 乙腈、2 ml 磷酸盐缓冲液活化和平衡，将待净化的溶液以自然滴液速度过柱，用2 ml 水淋洗，真空抽干。用1 ml 0.1 % 乙腈/水（3/7，v/v）溶液洗脱，真空抽干，收集洗脱液，过0.22 µm 滤膜后上机测定，基质标定量。

1.2.2 色谱条件 柱温为35 ℃；进样体积5 µl，流速为0.3 ml/min，流动相A 为0.1 % 甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，梯度为0～1.00 min，体积分数为10 % 的B 溶液；1.01～4.00 min，体积分数为10 %～35 % 的B 溶液，4.01～6.80 min，体积 分 数 为 35 % ～ 50 % 的 B 溶 液， 6.81～8.16 min，体积分数为50 % ～ 90 % 的B 溶液，8.17～10.0 min，体积分数为90 % ～10 % 的B 溶液。

1.2.3 质谱条件 离子化模式为电喷雾正离子模式，质谱扫描方式为 MRM，离子源温度为600 ℃、碰撞能量及定性定量离子质谱参数如表1 所示。

表1 质谱参数表

2 结果与分析

2.1 数学模型

上述公式依据样品测定原理给出，未考虑随机因素对测量结果的影响。

2.2 不确定度来源

根据检测过程喹诺酮药物含量计算公式，得到不确定度来源图，见图1。

图1 喹诺酮类药物检测过程中不确定度来源

2.3 不确定度计算

2.3.1 测量重复性引入的标准不确定度 由于分析过程中，很多操作引入的不确定度具有一定的重复性，如天平称量，移液管转移液体，容量瓶定容体积等操作等，因此，可以将此类分量进行归纳，引入重复性，即精密度，用于分析研究过程中随机变化引入的不确定度。精密度主要采用统计学方式来进行研究，对阳性样品中喹诺酮药物含量进行一系列平行测试，得到分析过程总随机变化，以该标准化差值的标准偏差评估试验过程的重复性不确定度。

在重复性条件下， 对同一样品中喹诺酮药物含量进行独立8 次测量，按照贝塞尔公式计算测量结果的标准差，单次测量的标准不确定度为：S（Xr）=，其算数平均值的标准不确定度为：uA（）=S（）=，重复条件下，氟喹诺酮类药物含量的相对标准不确定度为 urel（fr）= ur（）=，结果见表2。

表2 测量重复性引入不确定度

上述分量合并研究各种随机因素，如体积读数偏差、LC-MS/MS 的变动，样品混合不均匀以及HLB 固相萃取小柱对回收率的影响等，后续评定其他分量时，不再考虑各种随机因素。

2.3.2 试样称量引入的不确定度 试样称量引入的不确定度主要是天平的校准，天平的校准证书其允许误差是 ± 0.01 g，假定为均匀分布，其标准不确定度为：ur（m）==0.00577 g。禽蛋称样2.0 g，则其相对标准不确定度为：urel（m）==0.00289。

2.3.3 提取液V1引入的不确定度 （1）校准分量：用10 ml 单标吸管吸取10 ml 1 % 乙酸乙腈提取液，根据检定规程JJG196-2006[17]，10 mlA级吸管的允许误差为±0.02 ml，假定为三角分布，则10 ml 的单标吸管的相对标准不确定度为：urel（V1-1）==0.082。方法中，需提取重复一次，2 次移取独立不相关，因此，提取液引入的不确定度合成得：V1校==0.0116。（2）温度分量：提取液V1因温度变动引起的不确定度。室温（20±5℃），乙腈的膨胀系数为1.37×10-3/℃，乙酸的膨胀系数为1.10×10-3/℃则由温度引起的体积变化为△V=V×液体膨胀系数×△T=0.2×0.00110×5+19.8×0.00137×5=0.1367 ml，假定均匀分布，则：V1温=0.1367/=0.00292 ml。（3）提取液V1引入的相对标准不确定度为：ur（V1）== 0.000593。

2.3.4 用于测定的样品的定容体积V2引入的不确定度 用1 ml 0.1 % 乙腈/水（3/7，v/v）溶液洗脱，真空抽干，收集洗脱液，其校准、温度分量计算同2.3.3，V2引入的相对标准不确定度为ur（V2）= 0.000299。

2.3.5 标准溶液引入的不确定度 （1）标准储备液配制引入的不确定度。①标准品纯度引入的不确定度方法中采用的氟喹诺酮类标准品，纯度及证书提供的不确定度及计算结果up见表5。②标准品称量引入的不确定度准确称量标准品，称量时使用分辨率为0.00001 g 的分析天平，计算同2.3.2，其相对标准不确定度urel（m）结果见表5。③标准储备液定容引入的不确定度标准品用甲醇定容至10 ml，使用的容量瓶为10 mlA级，其校准、温度分量计算同2.3.3，标品定容引入不确定度uc（Vst）结果见表5。④在标准储备液配制溶液时引入的不确定度由上述 3 种合成，即urel（储）=，具体结果见表5。（2）标准溶液稀释引入的不确定度。稀释过程主要使用1 ml 单标线吸量管及10 ml容量瓶，具体计算方式见2.3.3，结果见表3。

表3 标准储备液稀释ur（V 中）引入的不确定度

（3）标准溶液配制引入不确定度。工作液配制引入不确定分量见表4，计算方式同2.3.3。（4）待测液浓度由标准溶液引入的不确定度，由上述3 种合成，即urel（Cs）=，结果如表5 所示。

表4 标准曲溶液配制过程ur（V 稀）引入的不确定度

表5 标准品引入的不确定度

2.3.6 标准曲线拟合引入不确定度 人工稀释为2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 ng/ ml 标准系列，校正曲线为Ai=a+bCi，由工作曲线变动性引起浓度 c 的标准不确定度分量为： SR=，u（c）=，urel（c）=，校正曲线各个参数如表6 所示。

表6 校正曲线参数

2.3.7 回收率ur（R）引入不确定度 采用t 检验法对各类化合物平均回收率进行显著性检验，t=，n=5，自由度为4。在置信概率为95 % 时，t 0.95（4）=2.78。即当检验值t≥2.78时，则与回收率100 % 有显著性差异，必须使用回收率修正结果；反之则不需要，计算可知，4 种喹诺酮类药物均无需采用回收率因子R 修正结果。

2.3.8 合成标准不确定度 （1）相对不确定度。各分量的相对标准不确定度见表8。（2）扩展不确定度。按照评定不确定度的测量模型计算喹诺酮药物含量的合成不确定度，ur（X）=，u=uc（X）×X，根据国际惯例95 % 置信概率，取包含因子K=2，则扩展不确定度为u（x）=k×u，结果表示见表8。（3）检测结果的表示。用液相色谱-串联质谱测定禽蛋样品中4 种氟喹诺酮类药物，结果见表8。

表7 回收率ur（R）引入不确定度

表8 各分量的相对标准不确定度及结果表示

3 结论

由图2 可以看出，对上述四种喹诺酮类药物含量检测结果影响最大的是urel（C），即校准曲线对样品测量值的影响，其次是标准溶液的配制及稀释urel（Cs）及样品回收率urel（R）和样品测量重复性urel（fr），因此，在对禽蛋中氟喹诺酮类药物含量进行检测时，应尽量确保标准溶液配制及稀释精准，增加标准溶液的测定次数，保证仪器较高的灵敏度和稳定性，多做平行样，提高检测技术，确保试验过程规范性和重现性，减小此类不确定度分量对检测结果的影响，也为农产品质量安全控制提供有效、可靠、可溯源的测量数据。

图2 相对不确定度直方图