羊肚菌细菌性病害病原菌的分离鉴定

张晨晓，赵书雪,2，曹田田，张燕娇，郭立忠，于 浩*

(1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266000；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东青岛 266100)

羊肚菌(Morchellasp.)隶属于子囊菌门(Ascomycota)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。羊肚菌的菌盖与羊肚相似，故得此名[2]。羊肚菌被视为一种营养价值较高的食药用菌[3]，子实体除含有粗脂肪、粗纤维、粗蛋白及氨基酸外[4]，还包含多糖等成分，不仅可以抑制肿瘤生长、增强免疫力，还可以助消化[5-6]。羊肚菌越来越受人们喜爱，羊肚菌的市场需求越来越大，但羊肚菌与其他常见食用菌不同，羊肚菌作为子囊菌，因其生长环境要求严格，影响羊肚菌产量的因素诸多，目前研究者对羊肚菌的栽培了解尚不完全。Ower[7]发明了采用室内栽培羊肚菌的专利，但2008年发现羊肚菌的产量降低，主要原因是菌种的退化及细菌的污染。

对食用菌危害较为常见的细菌种类有枯草杆菌黏液变种(Bacillussubitilisvar.mucoides)、蜡状芽孢杆菌黏液变种(Bacilluscereusvar.mucoides)、假单孢杆菌(Pseudomonasspp.)、黄单孢杆菌(Xanthomonasspp.)和欧文氏杆菌(Erwinia.)等[8]。因室外栽培羊肚菌的环境难于控制，环境中存在多种细菌，这对羊肚菌的栽培存在威胁，对细菌而言，羊肚菌子实体生长条件温湿度适宜，细菌可在整个羊肚菌生产环节影响羊肚菌的生产，尤其是出菇环节的细菌病害尤为明显，直接影响羊肚菌品质及产量。出菇时，羊肚菌细菌性病害主要是对子实体的侵袭，特别是遭遇高温高湿天气时，容易从羊肚菌子实体的菌柄与土壤交接的地方发生细菌性侵染及菌柄部位开始侵袭，被昆虫嚼食过的受伤部位也是细菌性病害高发的地方。细菌侵染后的培养料和子实体会出现湿斑、湿腐、水渍、酸败、黏液和腐烂等症状[8]。笔者从患病羊肚菌子实体中分离得到3种病原菌，通过侵染，发现菌株YDJ-1对羊肚菌子实体的生长存在威胁，对羊肚菌栽培过程中防御细菌性病害有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验菌株YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3由山东省应用真菌实验室于羊肚菌患病处分离获得，羊肚菌菌株G4由山东省应用真菌实验室从甘肃省陇南市采集的野生羊肚菌菌株分离获得。

1.2 培养基羊肚菌G4等食用菌使用PDA培养基培养，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3使用LB培养基培养。

1.3 试验方法

1.3.1羊肚菌病原菌株的筛选采集及观察。于青岛农业大学羊肚菌栽培的大棚中筛选患病的羊肚菌，记录羊肚菌的发病症状，收集羊肚菌患病子实体及周围的土壤，作为样本分离致病的病原菌。将采摘的患病羊肚菌子实体用75%乙醇进行表面消毒，用无菌水冲洗3次，剪切下大小0.5 mm2羊肚菌子实体患病部位，用显微镜观察。

1.3.2羊肚菌患病部位细菌的分离纯化。将羊肚菌子实体患病部位加入到离心管中，加入无菌水，振荡培养30 min，稀释涂布在LB培养基中，待菌落长出，观察菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征[9]，挑取不同菌落，扩大培养，提取基因组，扩增16S rRNA鉴定菌株，共筛选得到3个菌株，分别标记为YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3。

1.3.3YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3与羊肚菌G4的对峙研究。将过夜培养的YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3分别离心，收集菌体，将菌株的OD设定为OD6006.0，将羊肚菌G4打菌饼接种于平板中间，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3放在与菌饼相距2 cm处，以不加细菌的为对照，观察羊肚菌菌丝的生长状态。

1.3.4YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3对羊肚菌G4的侵染。采摘新鲜无病害的羊肚菌子实体，在羊肚菌子实体的菌盖、菌柄处用手术刀切割长度5 mm的伤口，取200 μL的菌液滴加在伤口处，以添加0.9%生理盐水作为对照，每个3个重复[10-11]，将侵染后的子实体放回大棚内继续培养，每12 h观察一次侵染结果，观察6 d。

1.3.53株病原菌对羊肚菌不同方式的侵染。参考“1.3.4”方法将3个病原菌接种到正在生长的羊肚菌子实体上，采用2种方法进行侵染，第一种将YDJ-1分别侵染到羊肚菌子实体菌盖及菌柄处，第二种将YDJ-1滴加到羊肚菌子实体的周围，观察羊肚菌子实体的状态。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌患病菌株的采集与鉴定与正常生长的羊肚菌比较，发现一些羊肚菌菌柄发红，不规则，轻轻捏菌柄触感软塌，有轻微出水现象，轻嗅有臭味，菌盖较正常生长得小，采摘后，于实验室分离鉴定病原菌。轻捏菌柄触感软塌，有轻微出水现象，轻嗅有臭味(图1a)，分离得到3株病原菌YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3(图1b)，菌株的形态特征见表1。通过革兰氏染色发现菌株YDJ-1和YDJ-2为革兰氏阴性菌，YDJ-3为革兰氏阳性菌。通过PCR鉴定，比对发现菌株YDJ-1属于Pseudomonas(假单孢菌属)；菌株YDJ-2属于Buttiauxella(布丘氏菌属)；菌株YDJ-3属于Microbacterium(微细菌属)。

注：a为患病羊肚菌的子实体；b为分离获得的病原菌，1为YDJ-1菌株，2为YDJ-2菌株，3为YDJ-3菌株

表1 YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3菌落形态特征

2.2 3株病原菌与羊肚菌的对峙情况待羊肚菌与3株病原菌共培养7 d后，观察羊肚菌菌丝的生长状况，发现菌株YDJ-1对羊肚菌菌丝生长有抑制作用，菌株YDJ-1与羊肚菌菌丝接触之处，羊肚菌菌丝出现轻微发红发褐的现象。菌株YDJ-2和YDJ-3对羊肚菌菌丝的生长无抑制作用(图2)。

注：1为羊肚菌菌丝对照平板，2为羊肚菌菌丝与YDJ-1对峙平板，3为羊肚菌菌丝与YDJ-2对峙平板，4为羊肚菌菌丝与YDJ-3对峙平板

2.3 3株病原菌侵染羊肚菌新鲜子实体情况将3株病原菌分别接种到羊肚菌的子实体中，观察病原菌对羊肚菌的侵染情况，发现菌株YDJ-1对离体羊肚菌子实体具有一定的侵染能力，被侵染的羊肚菌子实体菌柄变红褐色，触感发黏，轻嗅有细菌的臭味。另外2组细菌的侵染状况与生理盐水处理组相近(图3)。

注：1为生理盐水处理羊肚菌子实体，2为YDJ-1菌液处理羊肚菌子实体，3为YDJ-2菌液处理羊肚菌子实体，4为YDJ-3菌液处理羊肚菌子实体

2.4 YDJ-1菌株不同侵染方式对羊肚菌子实体的影响菌株YDJ-1对羊肚菌子实体存在致病性，采用2种方式对活体羊肚菌是否会患病进行验证。采用第一种方式侵染，当培养到第6天，发现被菌株YDJ-1的菌液侵染活体羊肚菌子实体菌盖和菌柄的羊肚菌生长正常，未出现被侵染现象，推测可能是羊肚菌自身可以抵御外界的侵染。用YDJ-1菌液浇灌羊肚菌子实体周围土壤，发现有10%羊肚菌子实体出现菌柄发红、变软等细菌病害的病症，推测是YDJ-1侵染作用所致(图4a-3)。继续延长菌株的侵染时间，当培养至14 d时，发现有40%的羊肚菌出现发病状况，子实体菌柄呈红褐色、有水渍，子实体基本不生长，均为羊肚菌幼菇；未发病的60%子实体，生长畸形、菌柄膨大(图4b)，进一步说明菌株YDJ-1可抑制羊肚菌的生长。

注：a-1为处理菌盖的羊肚菌子实体，a-2为处理菌柄的羊肚菌子实体，a-3为处理菌根部土壤的羊肚菌子实体；b为培养14 d时处理菌根部土壤的羊肚菌子实体

3 结论

羊肚菌室外栽培受到环境中病虫的污染，是羊肚菌减产的重要原因之一[12]，目前关于羊肚菌栽培过程中，真菌性病原菌报道较多，如He等[13]筛选羊肚菌白霉病的病原菌株长毛拟青霉(Paecilomycespenicillatus)，He等[14]筛选出羊肚菌盖腐病的病原菌Diploösporalongispora，常见的羊肚菌重要病原菌还有镰刀菌属[15-16]，余苗等[10]报道了由曲霉属真菌引起的羊肚菌白腐病，该研究通过对患病羊肚菌子实体的分离，筛选到3株细菌，通过培养时间及侵染方式，最终确定菌株YDJ-1(Pseudomonas)为羊肚菌的病原菌。