甘薯脱毒种苗无糖培养的影响因素研究

陈 顺，许玉婵，官锦燕，罗剑飘，陈双艳，罗 艺，罗青文，谭嘉娜*

(1.广东省科学院南繁种业研究所湛江研究中心，广东湛江 524300；2.崇左市江州区农业技术推广站，广西崇左 532200)

植物无糖培养技术，又称光自养微繁殖技术，是以CO2代替常规组织培养中的糖源作为植物生长所需的碳源，并通过控制影响植株生长的环境因子(如温度、湿度、光照强度、CO2浓度等)使植株由兼养型转变为自养型，低成本生产优质种苗的一种植物组织培养技术[1-3]。该技术于1997年引进我国[4]，近年来已广泛应用于作物快速繁殖[4-5]。在该技术培养下的植株生长发育快，培养周期缩短40%以上[1]，显著提高了种苗质量，综合成本平均降低了30%[6]。杨玉田等[7]研究表明，甘薯无糖培养苗较对照叶片增大，叶色浓绿，幼苗茁壮，移栽后成活率达到95%。由于无糖状态下外植体需要进行自养生长，要求外植体具有一定的形态大小，这就决定了无糖组织培养所取用的材料为继代苗，适用于组培的壮苗生根培养[8]。笔者利用建立的无糖培养体系，研究培养基质、培养液成分与体积、光照强度与光照时间及植株的完整性等因子对甘薯无糖培养期间生长情况的影响，以期提高组培种苗驯化期间的质量和成活率，进一步细化和提升甘薯脱毒种苗的工厂化无糖培养效率。

1 材料与方法

1.1 材料以广东省科学院南繁种业研究所湛江研究中心的甘薯脱毒组培苗作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1甘薯脱毒苗的接种。在超净工作台上，将灭菌后的培养基质倒入已灭菌的无糖培养盒中，基质厚度约3 cm，倒入1 000 mL营养液，将传统组织培养20～30 d的甘薯组培苗取出，无菌水洗净基部残留的培养基，将甘薯组培苗按80株/盒的规格接种。对照组使用同批次传统组培生根苗。

1.2.2甘薯脱毒苗无糖培养条件。将接种后的培养盒连接无糖培养装置，在温度为(27±2) ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为10 h/d，湿度为50%～65%，空气中CO2浓度为400～600 mg/m3的培养室内培养，培养处理设置见表1，每处理3组平行试验，定期观察并记录甘薯组培苗的生长状况。经过无糖培养后，测量培养苗的株高和茎粗，并移栽置温度为(28±1) ℃的温室大棚进行种植。对照组使用同批次传统组培苗袋装苗，对照组和试验组同时进行培养，控制培养的环境条件一致，培养时间一致，进行3组平行试验。

表1 无糖培养中培养条件的控制

1.2.3营养液成分对植株的影响。设计3种无糖培养液成分：①MS(有机物)+抑菌剂0.67 g/L；② MS(有机物)+花宝2号0.1 g/L+抑菌剂0.67 g/L；③ MS(有机物)+NAA 0.1 g/L+IBA 0.1 g/L+抑菌剂0.67 g/L。在上述试验后，设计营养液单一营养成分的梯度试验(表2)，以T3处理作为基准，探究每升培养液中适合无糖培养下植株生长的营养成分组合方案。

表2 培养液成分梯度试验

1.2.4植株的完整性对繁殖的影响。采用良种植株，分别为带有根系的甘薯脱毒继代苗和切除根系的甘薯脱毒继代苗，并进行无糖培养。

1.2.5培养液体积对植株的影响。在无糖培养试验中，添加的营养液体积梯度设置为900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400 mL。通过培养液体积的梯度试验，探究最适营养液体积。

1.2.6不同培养基质对植株的影响。采用黄金蛭石、椰糠、沙子、泥炭土、珍珠岩物种基质以体积比1∶1混合，设计10种不同搭配的培养基质：①沙子与珍珠岩(CK)； ②沙子与蛭石；③沙子与泥炭土；④沙子与椰糠；⑤珍珠岩与蛭石；⑥珍珠岩与泥炭土；⑦珍珠岩与椰糠；⑧蛭石与泥炭土；⑨蛭石与椰糠；⑩泥炭土与椰糠。

1.2.7光照强度对植株的影响。设计3个光照强度条件，研究光照强度对植株生长的影响。条件如下：①1根28 W日光灯(光照强度为2 000 lx)②2根28 W日光灯(光照强度为2 400 lx)③3根28 W日光灯(光照强度为2 900 lx)。对照(CK)为常规培养方式，光照强度为2 000 lx。

1.2.8光照时长对植株的影响。该试验针对光照时长设计了光照时长梯度试验，条件如下：8、9、10、11、12、13 h/d。对照(CK)为常规培养方式，光照时长为8 h。

1.2.9正交试验优化营养液成分组合。根据单因素试验结果，在不考虑各因素间的交互作用，将培养液成分中3个因素进行正交试验，每升培养液中各成分最优3因素3水平设计见表3。

表3 培养液成分优化的正交试验

根据正交表L9(34)安排试验，分别为：A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B3C2、A3B1C3、A3B2C1。培养条件：培养基质为泥炭土与珍珠岩(1∶1)，培养液体积为1 200 mL，植株带有根系，选择3根28 W日光灯(光照强度为2 900 lx)，光照时长为12 h/d，温度为(27±2) ℃，湿度为50%～65%(盒内湿度80%～95%)，CO2浓度为400～600 mg/m3。

2 结果与分析

2.1 营养液成分对植株的影响通过单因素方差分析方法分析了植株的株高和茎粗在不同培养液成分方案中的差异，结果见图1、2。从图1、2可见，各处理之间的株高和茎粗均存在显著性(P<0.05)，3种无糖培养液方案的株高和茎粗均显著高于CK，表现为T2>T3>T1>CK，可见，T2处理促进甘薯植株的生长效果最好。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；CK为常规组织培养

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；CK为常规组织培养

通过单因素方差分析方法，分析了培养液成分中大量元素母液、微量元素母液和铁盐母液体积量对甘薯脱毒苗植株的高度和茎粗的影响，结果见表4～6。由表4可知，当大量元素母液体积为50 mL时，甘薯脱毒苗株高显著高于其他体积处理；而体积为40、50和60 mL时，植株茎粗均显著高于CK，由此可知，大量元素母液体积量40、50和60 mL为该单因素试验的适宜水平。

表4 大量元素母液对植株高度和茎粗的影响

由表5可知，当微量元素母液体积量为3 mL时，株高显著高于其他体积处理，而体积量为1、3和7 mL时，植株的茎粗显著高于其他体积处理，但体积为3 mL时，植株的茎粗平均值相对最大，体积为5 mL时，植株生长正常，体积为7 mL时，植株长势较弱，因此微量元素最适宜的3个水平体积分别为1、3和5 mL。

表5 微量元素母液对植株高度和茎粗的影响

由表6可知，当铁盐母液体积量为3、9 mL时，甘薯脱毒苗株高显著高于其他体积处理；而当体积处理为3 mL时，茎粗大于体积为5和9 mL的植株，显著高于CK。当铁盐母液体积量为1、3和5 mL时，植株的叶片相对较大，叶色深绿，相对体积为7 mL处理的植株叶片较少。但体积为7 mL时，叶片较多，但较小，植株较矮小。由此可知，适宜的铁盐母液体积量分别为1、3和5 mL。

表6 铁盐母液对植株高度和茎粗的影响

2.2 植株完整性对繁殖的影响通过单因素方差分析的方法分析了植株的株高和茎粗在不同植株处理方式下的差异，结果见图3。由图3可知，接种的植株有根系时，株高显著高于CK。由图4可知，有根系的植株茎粗显著大于无根系植株，无根系植株的茎粗显著大于CK。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

2.3 培养液体积对植株的影响通过单因素方差分析对植株的株高和茎粗在不同培养液体积下的差异进行分析，结果见图5、6。由图5可见，培养液体积1 200 mL处理植株的株高与其他体积处理均具有显著性差异(P<0.05)，株高显著高于其他培养液体积处理的株高。由图6可知，当培养液体积为1 000和1 200 mL时[茎粗分别为(1.40±0.09)、(1.41±0.06) mm]，植株茎粗显著高于其他处理。因此，培养液体积为1 200 mL对植株的生长影响效果最好。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

2.4 不同培养基质对植株的影响通过单因素方差分析对植株的株高和茎粗在不同培养基质下的差异进行分析，结果见图7、8。由图7可知，甘薯脱毒种苗在各种培养基质中的株高各不相同，每个处理均存在光照不均匀现象，在珍珠岩与泥炭土组合(处理⑥)的培养基质中，甘薯种苗植株高度表现较好，显著高于其他培养基质下植株的高度。由图8可知，处理⑥和处理⑩的植株茎粗较大，显著大于其他处理组，处理③和处理⑧的植株茎粗也相对较大。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

2.5 光照强度对植株的影响由表7可知，随着光照强度的增强，甘薯脱毒种苗植株的高度和茎粗也随之增大。当光照强度大于2 400 lx时，株高显著高于低光照强度的植株高度。在不同光照处理下，茎粗无显著差异，但光照强度越高，茎粗越大。因此，光照强度对甘薯植株的生长具有明显的影响，且适宜光照强度为2 900 lx。

表7 光照强度对植株高度和茎粗的影响

2.6 光照时长对植株的影响通过单因素方差分析方法，对植株的株高和茎粗在不同光照时长下的差异进行分析，结果见图9。从图9可见，不同光照时长处理的植株高度均显著高于CK。当光照时长为12和13 h/d时，植株的高度显著高于其他处理组，光照时长为12 h/d处理的株高最高，而且其数值标准偏差较小。由图10可知，8、9 h/d处理的植株茎粗与CK差异不显著，光照时长为10、11、12和13 h/d处理与CK差异显著。光照时长为10和11 h/d的植株茎粗较大，而光照时长为12和13 h/d处理的植株茎粗较小。综上，最优水平为光照时间12 h/d。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

2.7 正交试验

2.7.1正交试验结果。选择培养液成分中的主要影响因素大量元素母液、微量元素母液和铁盐母液3个因素设计正交试验，在不考虑3因素之间存在交互作用的情况下，正交试验结果见表8、9。

2.7.2方差分析。由表8可知，以株高作为衡量指标时，大量元素母液对株高的影响作用最大，铁盐母液影响作用次之，微量元素母液影响作用最小。培养液3种主要成分最优组合为A2B2C2，大量元素母液体积量为50 mL，微量元素母液体积量为3 mL，铁盐母液体积量为3 mL。由表9可知，以植株茎粗作为衡量指标时，大量元素母液对植株茎粗的影响作用最大，微量元素母液影响作用次之，铁盐母液影响作用最小。培养液3种主要成分最优组合为A2B2C2，由此确定大量元素母液体积量为50 mL，微量元素母液体积量为3 mL，铁盐母液体积量为3 mL。

表8 株高正交试验结果

表9 茎粗正交试验结果

由表10可知，以株高作为衡量指标时，在不考虑因素之间存在交互作用的情况下，3种因素对植株高度均无显著影响，由F值大小可以看出因素主次顺序为A>C>B。

表10 株高方差分析

由表11可知，以植株茎粗作为衡量指标时，在不考虑因素之间存在交互作用的情况下，3种因素对植株的茎粗均无显著影响，由F值大小可以看出因素主次顺序为A>B>C。

表11 茎粗方差分析

3 讨论

夏瑞等[9]的樱桃李试管苗生根试验研究结果表明，不含糖的土壤支撑培养基中试管苗的生根率达到90.0%，且其根长显著高于含糖培养基。冯洁等[10]在马铃薯无糖培养过程中去除MS培养溶液中的有机成分，能够降低污染。该研究设计了3种培养液方案，添加了大量元素、微量元素、铁盐母液和一定量的生长调节剂，节省了糖和有机物，可降低成本40%[6]。从植株的生长状态和植株高度与茎粗对比，可以看出T3处理和T2处理明显优于T1处理，而根据衡量指标数据的对比，T2处理优于T3处理。除了考虑提高植株的吸收作用，培养液中各营养元素的合理搭配更为重要。从3种营养成分的梯度试验可以看出，随着体积的增大，植株的高度和茎粗呈抛物线曲线。说明在营养成分达到最适浓度前，营养液体积与株高和茎粗呈正相关；营养成分超过最适浓度后，营养液体积与株高和茎粗呈负相关。从正交试验结果可知，每种营养成分的最优水平组合的效果并不是最好的。在不考虑营养成分之间交互作用的情况下，进行直观分析和方差分析得出，培养液中最优组合为大量元素母液50 mL，微量元素母液3 mL，铁盐母液3 mL。由于营养成分之间存在交互作用，分析结果存在一定的局限性，但是该交互作用影响较小，这对今后进一步深入研究具有一定参考。

在接种苗的处理方式中，甘薯脱毒苗带根系的培养效果优于无根系处理和CK。说明植株存在根系更利于对培养液中的培养成分进行吸收，促进自身的生长发育。但是，无根系的植株仍能正常生长发育，并且比传统的组织培养效果好，故甘薯种苗接种过程中，有无根系的植株均可用于无糖培养，从而提高材料的利用率。

在培养液体积探究中，培养液体积过小和过大均不适合植株的生长发育。当培养液体积过小时，培养液中的营养成分和水分含量不足，难以满足植株生长需求，使得植株的生长发育状态欠佳。 当培养液体积过大时，培养盒内的水分溢出于培养基质表面，植株根系一直处于浸泡状态，水中缺乏空气导致根系无法正常呼吸，易出现烂根现象，导致植株无法正常吸收培养液中的营养成分来促进自身生长发育，生长状态较差。因此，合适的培养液体积有利于促进植株的生长发育，当培养液体积量为1 200 mL时，植株的生长状态最好。

传统组培通常使用琼脂、卡拉胶等凝胶性物质作为基质，植株根系发育比较细弱，移栽时易损伤。贾效成等[11]研究表明，无糖培养基质对油茶及种苗成活率的影响显著。在无糖培养中，通常使用黄金蛭石、珍珠岩、纤维素等多孔的无机材料作为培养基质。由于其良好的透气性，使得植株的根系氧气充足，促进植株根系的发育，增加其韧性，且多孔基质价格低廉，材料成本低。在培养基质的探究试验中，使用沙子、蛭石、泥炭土、珍珠岩和椰糠以体积比1∶1组合作为培养基质。在泥炭土与珍珠岩的培养基质中，植株的生长状态和植株高度、茎粗均表现较好。一方面，泥炭土为植株提供额外的碳源，促进植株的生长发育；另一方面，珍珠岩为植株根系提供了适度的空间，提高培养基质的透气性，促进植株根系发育，使得植株在该培养基质内生长表现较好。

光是植物进行光合作用的主要能量来源，而无糖培养技术是依靠植株自身的光合作用进行转化，供给自身生长发育消耗，且无糖组培苗有不需要经过炼苗的优势[12]。杨玉田等[7]研究表明，脱毒甘薯18试管苗在光照强度为3 000 lx，光照16 h的环境下进行培养，取得了良好的培养效果。在光照强度对植株生长影响的研究中，由于试验条件的限制，在空气中CO2浓度为400～600 mg/m3的培养室内，随着光照强度的增加，植株的生长状态也越来越好。说明培养容器内的CO2浓度尚未达到植物CO2补偿点，将CO2浓度和光照强度2个条件相结合继续探究，可使植株的生长状态得到进一步提高。试验条件具有一定的限制性，最优光照强度仅为2 900 lx。另外，光照时长对植株的生长状态也具有很大的影响作用。该试验中当光照时长为12和13 h/d时，甘薯植株的生长状态较好。但是，从衡量指标数据分析结果来看，光照时长为12 h/d为该试验的最优光照时长。

4 结论

以甘薯脱毒种苗为试验材料，建立无糖培养体系，替代传统组培小容器培养方法，使用大容器培养盒进行培养，改善植株生长环境。通过单因素试验和正交试验的方法，探究最适合甘薯脱毒种苗的无糖培养条件，使其生长状态达到最好。通过一系列的试验结果表明，在进行种苗接种时，使用的脱毒甘薯种苗需带有根系，可促进植株的生长发育。最优的无糖培养液营养成分方案为MS+0.1 g/L花宝2号+0.67 g/L抑菌剂，其中MS培养基的营养成分组合为大量元素母液(20倍浓缩液)50 mL、微量元素母液(200倍浓缩液)3 mL、铁盐母液(200倍浓缩液)3 mL。在无糖培养体系中，最优的室内培养基质为泥炭土与珍珠岩(1∶1)，培养液体积为1 200 mL，选择3根28 W日光灯(光照强度为2 900 lx)，光照时长为12 h/d。无糖培养结束后，将植株移栽于珍珠岩与泥炭土(体积比1∶1)组合基质的穴盆中培养。

该试验探究了无糖培养技术在甘薯脱毒种苗繁育上的应用情况，可为甘薯脱毒种苗进行无糖培养工厂化生产提供一定的借鉴作用。