兰州大尾羊脂联素及其受体基因全长cDNA克隆与表达模式分析

张德荣，孙渭博，曹 忻，李羽翡，柏家林

(1.西北民族大学 生物医学研究中心，兰州 730030；2.甘肃农业大学 动物科学技术学院，兰州 730070；3.西北民族大学 实验教学部，兰州 730030；4.甘肃省食品检验研究院，兰州 730070)

脂联素(adiponectin, APN)，也称脂肪连接蛋白，是由脂肪细胞分泌的一种具有生物活性的内源性多肽或蛋白质(一种具有保护作用的脂肪因子)，由N端信号肽、变异区域、N-胶原蛋白三螺旋区和C端球状区4 个结构域构成[1]。脂联素由APN基因编码，该基因最早定位在人类染色体的3q27，全长17 kb，在哺乳动物中高度保守，由3个外显子和2个内含子组成，编码247个氨基酸(外显子1不参与编码蛋白)，编码的APN蛋白分子质量约为30 ku[2-3]。脂联素前体经加工修饰可形成低分子质量(low-molecular-weight, LMW)蛋白与高分子质量(hight-molecular-weight, HMW)蛋白，两者在机体内具有独特的生物学功能[4-5]。作为一种脂肪细胞因子，脂联素必须与靶器官上的特异性受体结合才能发挥其生物学功能，Yamauchi等[6]研究表明脂联素存在脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂联素受体2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)两种亚型受体。AdipoRs含有7 个跨膜结构域，但结构和功能上完全不同于G蛋白偶联受体，AdipoR1基因主要在骨骼肌组织中表达，对脂联素球状区有高度亲和力；AdipoR2基因主要在脂肪和肝脏组织中表达，对全长、球形脂联素有中度亲和力，APN基因通过与AdipoRs结合直接参与腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase, AMPK)和过氧化物酶体增殖物激活受体-α(Peroxisome Proliferators-activated Receptor α, PPAR-α)途径，间接调节脂肪酸氧化、葡萄糖利用和糖异生等代谢及胰岛素的分泌[7-8]。APN基因的研究主要集中在人及啮齿动物，如人类肥胖、脂质代谢及胰岛素耐受等。在家畜动物中，陈星伊等[9]研究发现AdipoR1和AdipoR2基因参与秦川牛肌肉生长发育的调控；孟宪然等[10]在研究内蒙古绒山羊时发现APN基因是影响肉品质的重要候选基因；An等[11]研究表明APN基因影响绵羊早期生长速度、瘦肉量及胴体脂肪沉积深度等。此外，人们最初认为成熟的脂肪细胞是脂联素蛋白合成和分泌的唯一场所，但在后续的研究中发现，其在多种哺乳动物的心肌、垂体、成骨细胞、卵巢等组织中均有不同程度的表达[12]。因此，本研究以兰州大尾羊为试验对象，同源克隆和RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因的全长cDNA序列，运用实时荧光定量PCR技术分析脂联素及其受体基因在15种组织中的表达规律，为下一步开展绵羊脂联素及其受体在多克隆抗体制备及免疫组化等方面机制机理的研究打下基础，为后期开展的相关研究提供必要的理论依据与数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择3只健康且体况良好的6月龄兰州大尾羊(甘肃省永靖县瑞霖科技养殖有限公司)，经颈静脉放血处死后，无菌条件下采集15种组织：背最长肌、肩部皮下脂肪、内脏脂肪、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾、卵巢、睾丸、大肠、小肠、间脑、瘤胃和皱胃，将组织分割为1 cm3的小块，装入标记好的冻存管置于液氮中带回实验室，-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA提取与反转录

采用Takara RNAiso Plus总RNA 提取试剂盒分别提取15种组织总RNA，产物溶于DEPC水，-80 ℃保存，备用。采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification试剂盒对背最长肌、肩部皮下脂肪和肝脏组织中提取的总RNA进行反转录合成cDNA第一链，产物-20 ℃保存，备用。采用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒分别将15种组织中提取的总RNA进行反转录合成cDNA，产物于-20 ℃保存，备用。

1.3 引物设计与合成

1.3.1 简并引物设计与合成 根据人、鼠、大鼠、牛、山羊、鸡和猪的脂联素及其受体基因序列同源性比较结果，运用PrimerPrimer 5.0 软件设计其同源克隆的上下游引物，具体序列及产物大小见表1，引物由生工生物工程有限公司合成。

表1 绵羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源克隆引物序列

1.3.2 RACE引物设计与合成 根据绵羊脂联素及其受体同源克隆基因片段测序结果，运用PrimerPrimer 5.0软件设计其5′-RACE 特异性引物(Gene Specific Primer, GSP)和3′-RACE特异性引物。再依据绵羊脂联素及其受体RACE克隆测序结果，拼接全长cDNA序列，设计相应的验证PCR引物，具体引物序列及产物大小见表2，引物由生工生物工程有限公司合成。

表2 绵羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因RACE特异引物及验证PCR引物

1.3.3 实时荧光定量PCR引物设计与合成 根据RACE克隆出的APN、AdipoR1和AdipoR2基因全长cDNA 序列，运用PrimerPrimer 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物，以绵羊3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,GAPDH)作为内参基因(NM_001190390)，具体序列及产物大小见表3，引物由生工生物工程有限公司合成。

表3 绵羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因组织特异性qPCR引物

1.4 绵羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因克隆

1.4.1 同源克隆 分别取背最长肌、肩部皮下脂肪和肝脏组织cDNA 第一链稀释液2.0 μL，脂联素及其受体基因上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，TakaRaTaqDNA聚合酶1.5 μL，加双蒸水至25 μL。运用Touchdown PCR技术，分别扩增APN、AdipoR1和AdipoR2基因同源片段，具体反应条件见表4。PCR产物运用1 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

表4 绵羊APN、AdipoR1和 AdipoR2基因同源片段扩增条件

1.4.2 RACE克隆 分别以背最长肌、肩部皮下脂肪和肝脏组织总RNA反转录的第一链cDNA为模板，RACE克隆APN、AdipoR1和AdipoR2基因。RACE克隆反应体系(50 μL)为cDNA模板2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′-RACE GSP1 1 μL，3′-RACE GSP1 1 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，50×Advantage 2 Ploymerase Mix 1 μL和PCR-Grade Water 33.5 μL。APN基因5′-RACE和3′-RACE反应条件为：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25个循环。AdipoR1基因5′-RACE反应条件为：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 cycles；3′-RACE反应采用Touchdown PCR技术，反应条件为：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5个循环；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5个循环，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25 个循环。AdipoR2基因5′-RACE反应采用Touchdown PCR 技术，反应条件为：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5个循环；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5个循环，94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25个循环；3′RACE 反应条件为：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、2 min，25个循环。反应结束后，PCR产物用1 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)进行目标产物回收，并构建克隆载体测序。

1.4.3 PCR验证 分别以背最长肌、肩部皮下脂肪和肝脏组织总RNA反转录的第一链cDNA为模板，PCR扩增APN、AdipoR1和AdipoR2基因。PCR扩增反应体系(20 μL)为cDNA模板1 μL，验证上游引物1 μL，验证下游引物1 μL，dNTP Mix 1 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，10×Buffer 2 μL和PCR-Grade Water 13.5 μL。APN基因PCR反应条件为 95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，57 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30个循环；72 ℃、10 min。AdipoR1和AdipoR2基因PCR反应条件为95 ℃、2 min；98 ℃、2 min，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30个循环；72 ℃、10 min。反应结束后，PCR产物用0.9 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，用TakaRa MinREST Gel DNA Extraction Kit(Ver.3.0)进行目标产物回收，并构建克隆载体测序。

1.4.4 克隆载体构建及测序 选用 TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将脂联素及其受体基因同源克隆、5′-RACE、3′-RACE、验证 PCR的片段回收并与克隆载体T-V ector pMDTM19 Simple连接，过夜后热转化至E.coliCompetent Cell JM109感受态细胞中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落，提取质粒，送至生工生物工程有限公司使用通用引物进行测序。

1.5 实时荧光定量PCR

分别以15种组织反转录所得的cDNA链为模板，进行qPCR扩增，反应体系为cDNA模板1 μL、上下游引物各 0.2 μL、2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL和DEPC H2O建立25 μL qPCR反应体系，反应条件为94 ℃、2 min，94 ℃、5 s，57 ℃、30 s，40个循环。在LightCycler 480实时荧光定量PCR仪中测定APN、AdipoR1和AdipoR2在15种组织中的表达水平，每个反应重复3次。

1.6 生物信息学分析

从NCBI上分别下载人、鼠、大鼠、牛、山羊、鸡和猪等物种对应APN、AdipoR1和AdipoR2基因序列，利用MEGA软件进行同源性分析。

1.7 数据分析

所有基因在每个样品(组织)重复进行3次，数据以“平均值±标准差”表示。利用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析，不同组织的脂联素及其受体基因在其不同浓度下表达量的影响均采用单因子方差分析对其显著性进行检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 绵羊ANP基因同源克隆、RACE扩增及序列分析

以背最长肌的反转录cDNA第一链稀释液为模板，同源克隆出310 bp的ANP基因片段(图1-A)，再利用RACE技术，克隆出大小为950 bp的5′-RACE片段(图1-B)和1 500 bp的3′-RACE片段(图1-C)，拼接获得全长为2 101 bp的ANP基因cDNA(GenBank登录号：KJ1592123，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159213.1)，验证PCR扩增出大小为1 193 bp的ANP基因片段(图1-D)。通过MEGA分析显示，绵羊APN蛋白序列与山羊和牛的相似性较高(图2)。

2.2 绵羊 AdipoR1基因同源克隆、RACE扩增及序列分析

以肩部皮下脂肪的反转录cDNA第一链稀释液为模板，同源克隆出364 bp的AdipoR1基因片段(图3-A)，再利用RACE技术，克隆出大小为500 bp的5′-RACE片段(图3-B)和大小为1 600 bp的3′-RACE片段(图3-C)，拼接获得全长为2 035 bp的AdipoR1基因cDNA序列(GenBank登录号：KJ159212，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ159212.1)，验证PCR扩增出大小为1 100 bp的AdipoR1基因片段(图3-D)。通过MEGA分析显示，绵羊AdipoR1蛋白序列与山羊、牛、人、小鼠、大鼠和猪的相似性较高，而与鸡的相似性最低(图4)。

2.3 绵羊 AdipoR2基因同源克隆、RACE扩增及序列分析

以肝脏组织的反转录cDNA第一链稀释液为模板，同源克隆出绵羊AdipoR2基因大小为550 bp的同源片段(图5-A)；再利用RACE技术克隆出大小为1 100 bp的5′-RACE片段(图5-B)和700 bp的3′-RACE片段(图5-C)，拼接获得全长为1 809 bp的绵羊AdipoR2基因cDNA序列(GenBank登录号为：KF921623，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF921623.1)，验证 PCR 扩增出约1 100 bp的AdipoR2基因片段(图5-D)。通过MEGA分析显示，绵羊AdipoR2蛋白序列与山羊、牛、小鼠、大鼠、鸡和猪的相似性较高，而与人的相似性最低(图6)。

2.4 绵羊APN基因在15种组织中的相对表 达量

通过实时荧光定量技术检测绵羊ANP基因在15种组织样品中的相对表达量，结果见图7。结果表明，兰州大尾羊APN基因在15种组织中均有表达。其中，在背最长肌中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05)，其次是在心脏和瘤胃组织；在其他组织中相对表达量较低，差异不显著，在肩部皮下脂肪中的相对表达量最低。

2.5 绵羊 AdipoR1基因在15种组织中的相对表达量

通过实时荧光定量技术检测绵羊AdipoR1基因在15种组织样品中的相对表达量，结果见图8。结果表明兰州大尾羊AdipoR1基因在15种组织中均有表达。其中，在内脏脂肪和肩部皮下脂肪中的相对表达量最高，两者间差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他组织(P<0.05)；其次是脾脏、心脏、小肠、大肠、肝脏、肌肉和皱胃组织；在其他组织中相对表达量较低，差异不显著，在间脑组织中的相对表达量最低。

2.6 绵羊 AdipoR2基因在15种组织中的相对表达量

通过实时荧光定量技术检测绵羊AdipoR2基因在15种组织样品中的相对表达量，结果见图9。结果表明兰州大尾羊AdipoR2基因在15种组织中均有表达。其中，在内脏脂肪中的表达量最高，其次是肩部皮下脂肪，与肝脏、心脏、脾脏、大肠、小肠、皱胃等其他组织中表达量相比，差异极显著(P<0.01)，而在卵巢、睾丸、肺、肾脏、间脑、瘤胃中几乎不表达。

3 讨 论

研究表明APN基因经磷酸络氨酸衔接蛋白(phosphotyrosine interactingwith PH domain and leucine zipper 1, APPL1)作用后，可与脂联素受体特异性结合，激活AMPK、PPARα和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路进行下游糖类和脂肪代谢调节，从而发挥生物学功效[13-14]。APN基因在抗氧化[15]、抗消炎[16]、抗动脉粥硬化[17]、II型糖尿病[18]和胰岛素拮抗[19]以及心血管疾病[20]等方面发挥着重要的调节作用，其表达水平的变化直接影响游离脂肪酸和抑制炎症细胞因子的表达合成[21]，导致肥胖、心血管疾病和II型糖尿病等代谢综合症的发生[22]，说明该基因对人与畜禽的脂类代谢及相关疾病有着重要的影响。但绵羊APN基因的相关研究报道较少，而被誉为“长尾脂型”典型代表的兰州大尾羊[23]是研究肥胖、糖尿病等代谢疾病的最好载体，对其进行生脂机理调控研究和改善肉质水平有重要的参考价值。

本研究采集兰州大尾羊背最长肌、肩部皮下脂肪和肝脏组织，同源克隆出绵羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因cDNA，在此基础上运用RACE技术克隆绵羊APN、AdipoR1及AdipoR2基因5′-UTR和3′-UTR区域，随后分别进行拼接得到2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp的全长APN、AdipoR1及AdipoR2基因，并利用PCR验证完整性。

最初人们认为脂联素只在脂肪细胞中表达，但后来的研究发现脂联素在其他非脂肪细胞中也能表达。在人肝细胞、小鼠成骨细胞和破骨细胞、体外培养的骨骼肌细胞、猪胎盘和子宫、结肠黏液细胞、唾液腺上皮细胞、肌细胞、肌成纤维细胞等中均检测到脂联素的表达[24]。Ding等[25]通过克隆猪的APN基因并测定APN及其受体基因在不同组织中的表达量发现，APN基因和AdipoR2基因在皮下脂肪组织中大量表达，AdipoR2基因在肝脏、心脏、骨骼肌和脾脏组织中少量表达；AdipoR1基因在心脏和骨骼肌中大量表达，在脂肪、肝脏和脾脏组织中少量表达。Smolinska等[26]研究发现脂联素可通过影响猪发情周期中的子宫情况来调控猪的繁殖，并且发现脂联素及其受体基因和蛋白在猪妊娠早期的子宫、孕体和滋养层中均有表达，且在妊娠的不同时期表达量存在差异。张赛赛[27]研究发现，APN基因在小尾寒羊和杜泊羊中呈现出组织表达特异性，不同组织间，APN基因在皮下脂肪、肾周脂肪、腹股沟脂肪、臂二头肌、心血管组织中有表达，在肝脏、肾脏、卵巢组织中未检测到表达，提示APN基因的表达有一定的组织特异性，而且脂肪组织中的表达水平极显著高于其他组织，但在脂肪组织间无差异。李雪梅等[5]研究发现脂联素基因在藏山羊的脂肪组织中高表达，而在肌肉组织和胃中表达量较低，在心脏、肝脏和脾脏等组织中未检测到。本研究发现APN基因在肌肉、心脏和皱胃组织中高表达，在其余组织中少量表达；AdipoR1基因在内脏脂肪、皮下脂肪、脾脏、心脏、小肠、大肠、肝脏、皱胃和肌肉组织中高表达，在其余组织中少量表达；AdipoR2基因在内脏脂肪和皮下脂肪组织中高表达，在其余组织中表达量很低，几乎不表达。研究结果表明脂联素及其受体基因虽然在不同的组织中均存在一定程度的表达，尽管在同源性较高的物种间，其表达也存在明显的区别，这应与各物种的起源、衍变过程及生存环境等息息相关。APN基因在肌肉组织中高表达表明其可能参与肌肉中糖脂代谢及胰岛素敏感性调节等。AdipoR1和AdipoR2基因在脂肪组织中高表达，说明两者在脂肪组织中发挥至关重要的作用，可能参与脂肪细胞的分化、葡萄糖及脂肪酸的代谢等[28-29]，此外，在大肠、小肠、瘤胃及皱胃组织中均检测到APN和AdipoR1基因的表达，推断其在兰州大尾羊的消化吸收过程中存在特殊作用，但相关研究较少，需进一步验证。

4 结 论

本研究通过同源克隆及RACE克隆技术得到绵羊ANP、AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA全长分别为2 101 bp、2 035 bp和1 809 bp。在兰州大尾羊中，APN基因在肌肉组织中高表达，AdipoR1和AdipoR2基因在内脏脂肪和皮下脂肪中高表达。