放射性唾液腺功能损伤的再生医学研究——从干细胞到无细胞治疗

黄桂林

（遵义医科大学第五附属（珠海）医院口腔科，广东 珠海 519180）

放射治疗是头颈部恶性肿瘤治疗的主要手段之一，该区域唾液腺的放射性损伤常常导致口干症（xerostomia）及唾液分泌减少（hyposalivation）等后遗症。 近年来，调强放疗技术（intensity-modulated radiation therapy，IMRT） 和剂量调节手段在头颈部肿瘤放射治疗中逐步应用，其部分减少了造成唾液腺损害的放射剂量[1]。 但是，位于颌面部的唾液腺还是不能完全避免辐射的伤害。 目前，临床上常用的治疗方法包括应用催唾剂，如匹罗卡品（pilocarpine）、西维美林（cevimeline）及人工唾液等[2]。 辐射性损害的保护剂Amifostine 近年也在美国上市， 但其毒性可能对肿瘤组织具有保护作用，从而限制了这种药物在临床上的应用[3-4]。 我国学者王松灵教授最近发现，补充膳食中的硝酸盐能预防放射性损害引起的口干[5]。 以上这些治疗及预防措施多数只能部分减缓临床症状，并未能从根本上修复损伤后的唾液腺组织及恢复功能。 从再生医学的角度出发，本文将对辐射引起唾液腺分泌功能障碍的原因， 以及近年来干细胞及无细胞治疗的进展进行综述。

1 放射性唾液腺功能损伤的表现和机制

头颈部鳞状细胞癌 （head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）患者在接受放射治疗后的1 周内即出现急性唾液腺分泌减少症状， 减少量可达正常唾液流量的50%~60%[6]。 而慢性的唾液分泌减少通常是在头颈部恶性肿瘤放射治疗后的6 个月后发生[7]。 慢性口干可以导致语言障碍，吞咽、进食困难及消化不良，还可以导致猛性龋、牙周炎、口腔黏膜溃疡、感染等临床症状，对患者全身健康造成严重威胁。

放射性唾液腺功能损伤相关机制的研究主要是在动物模型（主要是鼠）上进行的。 在动物接受辐射后的3 d 内， 其唾液腺功能就会出现急性损伤并表现出相应的症状， 主要表现为腺泡细胞明显丧失、唾液流量减少较多、唾液成分明显改变[8]。 辐射的主要损伤机制包括急性DNA 损害、 腺泡细胞凋亡、钙通道调节异常即细胞内钙水平升高、活性氧（reactive oxygen species）对分泌细胞的损害。 同时，在鼠腮腺细胞中还发现ATP 酶释放后激活P2X7受体（purinergic receptor P2X7, P2RX7/P2X7）,导致P2RX7/P2X7 依赖性前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的释放[9]。在30~300 d 后的慢性期，唾液腺组织中纤维化的发生和唾液流量明显减少[10]。 慢性期唾液腺损害的主要机制包括Yes 相关蛋白（Yes-associated protein, YAP） 增加、 代偿性增生（compensatory proliferation）、细胞衰老、细胞骨架重排等，这些均导致了慢性病变期间唾液腺组织的损害。 另外，在急性、慢性期均能观察到血管神经损伤对唾液腺分泌功能有明显影响。

辐射引起唾液腺功能损伤的机制复杂，各种预防措施及恢复功能的治疗，如恢复血管、神经支配，利用药物保护腺体组织以减轻辐射损害，抗氧化治疗等都显示出了一定的效果。 然而，唾液腺分泌功能的恢复最终还是需要受损腺体中自身干/祖细胞的增殖、分化来补充已经耗竭的、负责分泌功能的腺泡细胞的数量[11]。近年来，随着干细胞及无细胞治疗研究的发展，放射性唾液腺损伤治疗的研究有了较大进展。

2 放射性唾液腺损伤的干细胞治疗及无细胞治疗的现状及前景

2.1 放射性唾液腺损伤的干细胞治疗

研究者最初设想的是在体外植入干细胞，待干细胞在损伤组织内存活、分化成具有功能结构的组织，从而恢复机体功能。 在早年的研究中包括了多种间充质干细胞（MSCs）的移植治疗，如利用骨髓MSCs、造血干细胞、人羊膜MSCs、牙髓干细胞、唾液腺干细胞、 皮肤MSCs 等修复不同组织的损伤[12]。我们将人羊膜MSCs 经腺体局部注射到放射性损伤SD 大鼠唾液腺组织中， 发现干细胞在体内存活并部分恢复了分泌功能[13]。Lim 等[14]将人脂肪MSCs连续3 周（每周1 次）经C3H 鼠的尾静脉注射，12 周后，检测结果发现放射性损伤唾液腺的唾液流率明显增加,唾液分泌延迟时间（salivation lag times）明显缩短，在第4 周时，在损伤腺体内还能找到移植的脂肪MSCs， 这些干细胞部分已经分化成了具有分泌功能的颌下腺上皮细胞 （salivary gland epithelial cells, SGCs）。 Pringle 等[15]将人颌下腺组织中分离培养得到的、在体外培养具有自我更新能力的c-kit+成体干细胞直接注射到辐射后损伤的鼠唾液腺腺体组织中，结果显示，这些c-kit+干细胞在鼠的体内能自我更新、分化，最后具有修复唾液腺的分泌功能。Lombaert 等[16]将唾液腺干细胞移植到放射性损伤的唾液腺组织中后，干细胞能定植在唾液腺的主要导管处分化成腺泡细胞， 并形成腺泡样及导管样结构，进而改善腺体的分泌功能。 随后的一系列研究发现，c-kit+的唾液腺成体干细胞在修复放射性损伤唾液腺功能方面相比其他的干细胞， 具有明显的优势[15]。尽管c-kit+干细胞在修复放射性损伤唾液腺方面具有明显优势，但是在作为干细胞供体来源的腺体中，这类细胞的数量却很少，而且随着年龄的增加，数量减少得更加明显，导致治疗性来源的干细胞获取困难[17]。

放射性唾液腺损伤的干细胞治疗除了干细胞来源不足、数量不足等问题外，还面临着许多其他挑战。 如移植到组织内的单个干细胞很难在受体细胞、神经及血管再生，以及炎症调节过程中会产生协同效应[18]。另外，用于自体移植的唾液腺干细胞还存在免疫反应，植入体内瘤变，细胞在体内能否长期存活、分化及增殖，进而发挥功能等问题。 而且MSCs 在体内长期存活并分化为腺泡细胞的证据并不确切。 有报道称，干细胞移植后的1 周，只有<1%的细胞能够存活下来[19]。 Su 等[20]把这些挑战总结归纳为：①获得唾液腺干细胞进行侵入性手术存在困难；②获取的唾液腺组织有限，难以进行干细胞扩增；③将干细胞输送到损伤组织存在困难，如通过血管输送干细胞很可能导致血栓栓塞的并发症；④如是异体移植干细胞则可能产生排斥反应；⑤唾液腺干细胞在运输配送方面存在问题。

有学者在对唾液腺主导管进行结扎制作的腺体损伤模型中发现，结扎导致腺体内的腺泡上皮细胞损伤，而这种损伤可以被腺体内位于导管内皮的唾 液 腺 干/祖 细 胞 （salivary gland stem/progenitor cells）通过增殖和分化而修复[21]。 另外，人们观察到少数接受IMRT 的头颈肿瘤患者， 其分泌功能可以部分自行恢复[22]。以上研究表明，无论是导管结扎的机械性损伤还是放射性损伤的腺体组织，其自身的内源性干细胞均能在一定条件下增殖、分化，从而对损伤的腺体组织进行自我修复，进而恢复腺体的分泌功能。 人们以往观察到的干细胞移植修复放射性损伤唾液腺功能的原因可能并非是植入腺体组织内干细胞分化成腺泡细胞的结果，而是移植的干细胞通过旁分泌作用于腺体自身内源性干细胞的结果。 也就是说，放射性损伤后，唾液腺组织的内源性干细胞可以在一定条件的刺激下增殖、 分化，进行受损腺体的功能修复。Mimeault 等[23]认为，组织内存活并驻留的干细胞能够继续释放生长因子对损伤的组织进行修复， 并能分化为组织特异性细胞（tissue-specific cells）。Pringle 等[15]研究发现，通过激活唾液腺组织中受到放射性损伤而处于休眠状态的内源性干细胞，可以自我修复损伤唾液腺的部分分泌功能。 Nguyen 等[24]也证实了放射性损伤后，鼠的腮腺组织内仍能够分离培养出能形成腺体细胞微球（salisphere）的单个细胞，他们进而认为放射性损伤唾液腺功能的修复可以通过这些干细胞的分化、增殖来实现。 以上研究均说明，只要能激活放射性损伤唾液腺组织内本身尚存的、处于休眠状态的干细胞，促使它们增殖、分化为功能性腺泡细胞，进而恢复分泌功能，就能达到修复损伤腺体功能的目的。 这些研究成果为无细胞治疗的研究提供了理论依据。

2.2 放射性唾液腺损伤的无细胞治疗

近年来，干细胞治疗的模式开始逐步转变。 最初人们设想的干细胞在病灶区增殖、分化，重新构建组织结构的愿望并未完全实现。 有研究发现，被标记的MSCs 注入体内后， 虽然有部分细胞能够到达受植靶器官，但这些干细胞很快就消失了。 动物实验研究证实， 经静脉注入的MSCs 虽然有少部分能够到达受损组织，但大部分都被肺部的毛细血管拦截并清除了[25]。 尽管干细胞能否在体内存活的问题受到质疑， 但MSCs 植入体内的短期治疗效果是肯定的。 多年来的研究发现，MSCs 能产生大量的生长因子并能调节免疫系统。 有研究也证实了SD 大鼠唾液腺细胞与人羊膜上皮细胞（amniotic epithelial cell）之间存在细胞旁分泌的交互作用，细胞因子在细胞之间的相互影响[26]。基于这些发现，学者们逐渐意识到移植到损伤组织内的干细胞起到的修复治疗作用实际是旁分泌因子的结果，而非移植入体内存活的干细胞进行再生修复的结果[27]。Bruno 等[28]及Lai 等[29]的研究分别证实了MSCs 来源的细胞微囊泡（microvesicles，MVs）、外泌体能防止肾脏损伤，减少心肌梗死的面积。随后，包括MSCs 的细胞裂解液（extract）、分泌物（secretome）、外囊泡（EVs）及外泌体对放射性损伤组织再生修复的研究均证实了它们的治疗效果。 Tran 等[30]在前期应用骨髓来源细胞移植重建辐射损伤的唾液腺功能成功的基础上，将该细胞裂解后的胞内可溶性物质用于治疗放射性损伤小鼠的腺体功能，结果发现，无论是局部腺体内注射还是静脉注射，裂解液均能修复唾液腺的功能，保护唾液腺的腺泡细胞、导管及肌上皮细胞和干细胞， 还能促进损伤组织中细胞和血管增殖，上调与组织再生和修复相关的基因， 如MMP2、CyclinD1、BMP7、EGF、NGF 基因。 他们将这种细胞提取物命名为“骨髓细胞汤（bone marrow soup）”。 An等[31]在研究低氧预处理脂肪干细胞修复放射性损伤唾液腺功能的机制时发现，放射损伤后，唾液腺组织内上皮细胞、内皮细胞、肌上皮细胞和涎腺干细胞均受到MSCs 分泌的蛋白质组 （secreted proteome）的保护，其富含GM-CSF、VEGF、IL-6、IGF-1等促进组织修复的相关因子，他们认为放射损伤唾液腺组织修复的部分原因应该是MSCs 分泌的营养因子作用的结果。 Lombaert 等[16]总结了MSCs 中含有 的EGF、FGF2/7、G-CSF、SHH、VEGF、WNT 等 各种细胞因子的作用：它们通过各种信号途径阻止放射性损伤细胞的凋亡，促进腺体内处于休眠状态的内源性干细胞增殖，减少氧化应激反应和脂质的过氧化反应；用这些分泌物修复损伤组织的效果明显优于全细胞、单个或多个因子的联合应用。 Su 等[20]切取人的小唾液腺（颊腺）后进行唾液腺干细胞分离、扩增，然后对干细胞进行3 个循环的冻融，高速离心后获得颊部唾液腺干细胞提取液 （labial stem cells extract，LSCE），将这些提取液经血管注射到放射性唾液腺损伤的小鼠体内，损伤的唾液腺功能得到部分恢复。 他们还检测到这些提取液中主要含有与血管形成相关的生物因子（FGF-1、FGF-2、KGF、angiopoietin、uPA、VEGF）和有神经营养作用的血管形成因子（PEDF、PTX3、VEGF）。 这些生物因子对放射性损伤的唾液腺均有保护和功能修复作用。 如在LSCE 中表达最高的FGF-2，是一种众所周知的有丝分裂素，在血管生成和伤口愈合中起重要作用。 另外，转染内皮细胞的FGF-2 是放射性损伤唾液腺治疗的关键因子。 该因子对放射诱导的唾液腺细胞凋亡也具有明显的保护作用[32-33]。 这些研究说明，利用干细胞分泌的生物活性因子就有可能修复放射性损伤的唾液腺组织，进而恢复其分泌功能。

随着研究的进展， 人们逐步认识到应用MSCs来源的EVs 正成为可能代替干细胞治疗的有效手段。 EVs 是细胞释放的一类膜性小囊，主要包括外泌体和MVs。 EVs 中含有多种生物活性物质，如mRNA、 miRNA、非编码RNA（non-coding RNA）、蛋白、脂质体及DNA。这些物质具有减轻炎症、促血管生成和促进损伤组织内干/祖细胞存活及增殖的组织修复作用[34]。

虽然迄今为止我们还未查阅到有关EVs 修复放射性损伤唾液腺功能的相关信息。 EVs 在修复造血系统、肝脏、肺、消化道系统及皮肤的放射性损伤中有相关报道[35]。有研究证实，MSCs 可通过分泌EVs发挥其复杂的旁分泌抗炎、 抗纤维化和促再生作用，进而修复放射性损伤的组织[36]。EVs 主要是通过提高组织或器官中干/祖细胞的增生及存活来促进血管增生，抗炎、抗氧化作用，以及减少纤维化发生来达到修复组织放射性损伤的目的[37]。在神经系统、免疫系统及心血管系统疾病的治疗研究中，MSCs外泌体也表现出了理想的组织修复效果[38]。 外泌体对组织损伤修复的主要机制包括减轻炎症反应、促血管生成及促进损伤组织内干/祖细胞存活及增殖的组织修复作用[34]。 还有研究发现，受到辐射的细胞膜上高表达能促进外泌体被受损细胞摄取整合素和四磷酸复合物CD29/CD81[39]。外泌体可通过miRNA 保护辐射对组织造成的急性或慢性损伤，这表明辐射照射后，细胞可能利用外泌体来增加其对电离辐射的抵抗力[40]。 miRNA-210 可通过控制缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的转录从而对辐射损伤的细胞DNA 进行有效修复[41]。到目前为止，外泌体修复放射性损伤组织的具体作用机制并不清楚。Pu 等[35]在造血系统放射性损伤的研究中认为， 其机制包括3 个方面： ①外泌体中的miRNA 对放射损伤的血细胞具有促进再生和抗凋亡作用， 比如骨髓基质干细胞外泌体中，miRNA-221、miRNA-451、miRNA-654-3p 能促进放射损伤骨髓细胞再生， 而miRNA-210-5p、miRNA-106b-3p 和miRNA-155-5p 能防止血细胞的凋亡；②外泌体可以通过刺激造血相关细胞因子的分泌来恢复造血功能，研究表明，外泌体能够在体外诱导巨噬细胞产生高水平的造血相关细胞因子，如G-CSF、IL-6、IL-8及VEGF； ③骨髓MSCs 外泌体能直接恢复辐射后的骨髓MSCs[35]。

2.3 放射性唾液腺损伤再生医学研究的前景

非细胞治疗在放射性损伤组织修复再生的研究中表现出良好的效果，也给以后可能的标准化治疗提供了希望。 但是，包括其他组织在内的唾液腺放射性损伤的非细胞修复治疗尚存在许多问题，如放射性组织损伤修复的具体机制， 特别是miRNA及non-coding RNA 等的再生修复机制仍不清楚，有待深入研究。 另外，MSCs 分泌的细胞因子和（或）外泌体携带物的稳定性问题， 如MSCs 在体外低氧预处理后，其分泌的细胞因子与常氧处理后的细胞因子有一定变化；而体外培养条件也会影响干细胞外泌体中miRNA 的携带量[42]。 此外，无细胞治疗的细胞因子或是外泌体在纯化、所含成分的定性及定量上都存在许多困难。 这些因素都影响了研究结果的一致性，也是下一步需要研究的问题。 不过，多年的研究也证实，无论是MSCs 的裂解液、分泌物蛋白还是EVs，在放射性唾液腺或其他组织/器官损伤中的修复治疗效果都是肯定的。 我们认为，放射性唾液腺功能损害的修复应该包括再生医学在内的多种手段的综合治疗，这样才可能达到更好的治疗效果。