血栓炎症反应的研究进展

郭弯弯，褚雅歆，乔蕊

(北京大学第三医院检验科，北京100191)

炎症反应和血栓形成是紧密相连的过程，而异常和过度激活的炎症反应可导致机体凝血系统过度激活，形成血栓炎症反应状态[1]。随着研究的深入，人们发现炎症反应和血栓形成之间这种复杂的交互影响，在许多疾病的发生及进展中扮演着重要角色。本文将综述血栓炎症反应发生的机制，以及其在脓毒症、子痫前期、新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)中的作用。

1 炎症反应促进高凝/血栓形成

在临床中，即使在抗血栓药物的治疗下，仍不能完全预防血栓形成，究其原因，除抗血栓药物的剂量不足、个体差异外，也可能是其他机制介导了血栓形成，从而造成了抗血栓药物的治疗缺口。临床发现，感染、自身免疫病等炎症状态下，患者血栓事件的风险增加，提示炎症反应可能通过其他途径促进血栓形成。

1.1炎症介导内皮细胞功能障碍 正常内皮细胞可以通过产生胞外核苷酸酶、血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)，释放前列腺素I2(prostaglandin I2，PGI2)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等方式发挥抗血栓的作用[2]。在炎症反应中，白细胞等活化会产生大量的细胞因子，如白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等，这些细胞因子会导致内皮细胞的功能障碍。例如，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可通过抑制p38 MAPK通路降低内皮细胞一氧化氮合酶基因表达，进而降低内皮细胞内NO水平，导致内皮细胞功能障碍和血管收缩异常[3]。功能障碍的内皮细胞除其本身的抗血栓作用消失外，也可通过释放血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，表达组织因子(tissue factor，TF)，为凝血因子提供活化表面等方式促进血栓的形成。

1.2炎症促进血小板生成及活化 炎症可促进巨核细胞的生成。炎症可通过血小板生成素(thrombopoietin，TPO)依赖性方式促进巨核细胞的生成。研究表明，IL-6可增加肝脏TPOmRNA的表达进而增加血浆TPO的水平[4]。炎症亦可通过非TPO依赖性方式促进巨核细胞的生成。造血干细胞中存在巨核细胞偏向型亚群即vWF、CD41高表达亚群，在急性炎症时，巨核细胞偏向型造血干细胞亚群迅速活化，快速补充消耗的巨核细胞[5]。

炎症可促进巨核细胞产生血小板。炎症中产生的细胞因子，如IL-1可使巨核细胞以一种独特的破裂方式产生血小板，迅速补充体内被消耗的血小板[6]。趋化因子如趋化因子配体(chemokine ligand 5, CCL5)可通过与巨核细胞上的趋化因子受体5(chemokine receptor 5, CCR5)识别，促进血小板的生成[7]。此外，刺激巨核细胞上的Toll样受体2(Toll-like receptor-2，TLR-2)也可刺激巨核细胞的成熟及调节巨核细胞的表型，促进血小板的产生[8]。

炎症反应可通过多种方式促进血小板的活化。活化的白细胞可释放血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)，促进血小板的活化与聚集[9]。长期暴露于肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可导致血小板的高反应性，促进血小板的活化[10]。此外，中性粒细胞活化后释放的中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)可通过其含有的组蛋白等促进血小板的活化[11]。

1.3炎症反应促进凝血因子活性升高 炎症反应状态下，血液循环中的凝血因子活性增加。gasdermin D(GSDMD)依赖的巨噬细胞的凋亡可导致巨噬细胞释放含有TF的微粒[12]。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)在调节TF的活性中发挥着重要作用，而损伤的血管壁细胞可释放PDI，促进TF的活化[13]，同时，血小板活化及内皮细胞损伤时，外化的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)表面也可促进TF的活化，启动外源性凝血途径。此外，炎症反应也可促进纤维蛋白原、Ⅷ因子等急性期反应蛋白的产生。中性粒细胞活化时释放的NETs亦可促进凝血酶的产生。这些机制最终导致血液循环中凝血因子的质和量升高。

1.4炎症反应抑制抗凝和纤溶系统 中性粒细胞活化产生的NETs中含有中性粒细胞弹性蛋白酶、组蛋白、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等物质，这些物质在发挥抗菌作用的同时，也具有抑制抗凝系统的作用。中性粒细胞弹性蛋白酶能够蛋白水解组织因子途径抑制物[14]。组蛋白可与TM和蛋白C结合，抑制TM依赖的蛋白C的活化，抑制抗凝系统[15]。此外，NETs可激活血小板和内皮细胞，促进纤溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor type-1，PAI1)的释放[16]，炎症细胞释放的细胞因子如IL-6也可促进PAI1产生[17]，抑制纤溶酶原转化为纤溶酶，抑制纤溶系统。

2 高凝/血栓形成促进炎症反应进展

2.1血小板介导和促进炎症反应发生 既往研究更多聚焦于血小板在止血和血栓形成中的作用上，近几年，对血小板功能认识深入研究发现，血小板在炎症反应中也发挥着重要作用，它可以通过表面受体、释放颗粒内容物、微粒等方式与许多免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等相互作用，参与到机体的炎症反应中。

2.1.1血小板的激活与分群 血小板大小、年龄、体积、内容物、蛋白质表达谱等方面存在着明显的异质性，这为血小板像白细胞一样分群提供了基础。根据现有研究，在血小板活化状态下，其主要可以分为两群，即聚集血小板、促凝血小板。不同血小板群之间会有部分的重合。不同血小板群的特点不同。促凝血小板其形态呈气球样变，可释放含有促血栓及促炎物质的微粒[18]，同时，促凝血小板膜暴露PS，为凝血酶原酶复合体形成提供膜表面，促进伤口部位的凝血级联反应[19]。聚集血小板主要通过其表面的糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体与纤维蛋白原结合，促进血小板的聚集[20]。在血小板对炎症的促进作用中，促凝血小板可能发挥了更加重要的作用。研究发现，在小鼠实验中，促凝血小板与中性粒细胞相互作用可加重缺血性卒中时的脑损伤[21]。

2.1.2血小板释放微粒 血小板源性微粒参与了多种血栓炎症反应相关疾病的病理过程。在许多疾病中，其血小板源性微粒的含量增多，且其含量与疾病的严重程度相关。研究表明，在类风湿关节炎患者中，其关节液中含有大量的带有血小板标志物CD41a的微粒，但是在骨关节炎患者的关节液中，并未发现大量血小板源性的微粒[22]。动脉粥样硬化作为一种慢性血管炎性疾病，血小板源性微粒在其发生和进展中也发挥着重要作用。研究表明，动脉粥样硬化患者中，血液中血小板源性微粒的含量明显升高[23]，微粒中大量的CCL5沉积于激活的内皮细胞上，促进白细胞聚集至动脉粥样硬化斑块处，促进动脉粥样硬化的进展[24]。

血小板源性微粒可通过多种方式促进血栓炎症反应相关疾病的发生与进展。(1)微粒通过与靶向细胞融合，使靶向细胞获得微粒上的功能性受体。有实验表明，用胶原或凝血酶激活的血小板会释放富含CXCR4的血小板源性微粒，将不表达CXCR4的细胞与血小板源性微粒共同孵育，可以使其获得CXCR4功能性受体[25]。(2)微粒可通过释放内容物的方式，促进血栓炎症反应。例如，血小板源性微粒中的线粒体可与中性粒细胞相互作用，促进中性粒细胞的活化[26]。(3)诱导白细胞炎性表面标志物的表达并增强其趋化性。实验表明，单核细胞与血小板源性微粒共孵育后，单核细胞表面标志物的表型向吞噬表型转变，单核细胞表面细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达增加，单核细胞与内皮细胞的黏附性增强。(4)促进内皮细胞功能障碍。血小板源性微粒可通过促进内皮细胞的氧化应激、降低内皮细胞NO的浓度等机制导致内皮细胞的功能障碍。

2.1.3血小板与白细胞的相互作用 血小板可促进白细胞的活化，增强白细胞的功能。研究表明，血小板可通过PAF促进血管周围肥大细胞脱颗粒，导致血管渗漏、组织损伤和炎症[27]。血小板与单核细胞相互作用，促进单核细胞表面CD40、P选择素糖蛋白配体1(PSGL1)等表达增强[28]。也有研究表明，在血小板-中性粒细胞聚集体中，中性粒细胞的黏附、吞噬、细胞内杀伤作用增强[29]。此外，血小板与中性粒细胞相互作用，可促进NETs的产生。既往研究认为，血小板促进NETs形成的作用仅在细菌感染时存在，即在细菌脂多糖(LPS)存在时，血小板通过Toll样受体4(TLR4)促进中性粒细胞活化，进而促进NETs的形成[30]。但随着研究的深入，发现不仅在细菌感染时，在病毒感染和无菌炎症时，血小板也可促进NETs的形成[31-32]。当实验中诱导血小板耗竭时，NETs的形成明显减少[33]。NETs不仅具有促炎的作用，还具有促进高凝/血栓形成的作用，其与多种疾病的严重程度和预后相关，如在小鼠实验中发现血浆中NETs的水平与脓毒症休克的严重程度与致死率相关[34]；在急性胰腺炎中，NETs的水平与疾病的严重程度相关[35]。

2.2凝血因子活化促进炎症反应

2.2.1凝血酶促进炎症反应 凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，其主要通过细胞表面的G-蛋白偶联的蛋白酶激活受体-1、2、3、4发挥作用。研究表明，凝血酶能够通过蛋白酶活化受体-1(protease-activated receptors-1，PAR-1)促进巨噬细胞分化为具有致炎作用的M1样表型，且变性失活的凝血酶仍然能够有效的诱导巨噬细胞的促炎反应，这表明凝血酶也能通过其他途径诱导信号转导，但具体的机制尚不明确[36]。此外，凝血酶还可诱导巨核细胞中环氧化物酶-2的表达，促进前列腺素E2的释放，促进炎症反应[37]。凝血酶能够与脊髓运动神经元上的凝血酶受体PAR-1相互作用，通过Src/ERK/STAT3信号通路上调CXCL8的表达，促进白细胞的招募与活化，继而促进腰椎间盘突出症神经根炎的发生与发展，推动其慢性炎症过程[38]；凝血酶也可诱导小胶质细胞产生炎性介质，如IL-1β、IL-18，介导脑出血后的致死性脑水肿及血脑屏障的破坏，在脑出血后继发性脑损伤中发挥着重要作用[39]；凝血酶还能通过PAR-1，协助增强细菌诱导子宫内膜内皮细胞产生与免疫细胞募集和存活有关的趋化因子，促进免疫细胞募集至子宫内膜处，导致子宫炎症反应[40]。

2.2.2纤维蛋白(原)促进炎症反应 纤维蛋白原能够与多种炎症细胞相互作用，促进炎症反应。纤维蛋白原能够激活中性粒细胞，增强中性粒细胞的吞噬功能及抗体依赖的细胞毒作用，延缓细胞的凋亡[41]；能够活化单核细胞中的NF-kB转录因子，对NF-kB依赖的基因转录有强烈的刺激作用，进而改变TNF-α、IL-1、TF等蛋白的表达；纤维蛋白原能够促进单核细胞的活化，促进单核细胞与内皮细胞的黏附[42]。此外，纤维蛋白原或纤维蛋白的降解产物可以通过影响白细胞的迁移和细胞因子的产生来调节炎症反应。纤维蛋白(原)的促炎作用也参与了多种疾病的进展。子痫前期中，纤维蛋白原能够促进单核细胞-内皮细胞的黏附和血管的生成，参与子痫前期的发病过程[42]。纤维蛋白原能够激活小胶质细胞，与神经炎症和神经元/轴突损伤有关[43]。

2.3抗凝蛋白减低导致炎症抑制作用减弱 抗凝蛋白能够抑制炎症反应。(1)抗凝血酶的抗炎作用：抗凝血酶可与抑制促炎反应的特定的细胞受体如CD13、CD300f、LRP-1等结合发挥抗炎作用[44]，亦可通过刺激内皮细胞释放PGI2间接发挥抗炎作用。(2)活化蛋白C(APC)的抗炎作用：APC可通过与内皮细胞上的蛋白C受体相互作用，降低血清中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等细胞因子的水平，抑制炎症反应[45]；APC也可抑制中性粒细胞NETs的形成[46]。在炎症状态下，因为抗凝蛋白的消耗过多或者合成减少，导致循环中的抗凝蛋白含量降低，进而对炎症的抑制作用减弱。

2.4纤溶系统调节炎症反应 纤溶系统在调节炎症反应中也发挥着重要作用。(1)纤溶酶(原)参与了炎症产生阶段。纤溶酶(原)能够促进巨噬细胞迁移至炎症部位，其机制可能与解除白细胞与纤维蛋白(原)相互作用造成的迁移限制相关[47]。纤溶酶(原)可增强巨噬细胞的吞噬功能。动物实验中发现，在纤溶酶(原)缺陷小鼠中，其许多吞噬相关基因表达下调，巨噬细胞的吞噬功能降低[48]。(2)纤溶酶(原)参与了炎症消退阶段。纤溶酶(原)可调节巨噬细胞表型，诱导巨噬细胞向M2型极化，促进中性粒细胞的凋亡[49]。

3 血栓炎症反应与疾病

3.1脓毒症 脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，因其致死率高，预后较差，受到广泛重视[50]。在脓毒症患者中，合并弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)的患者死亡率约为未合并DIC者的2倍[51]。DIC所致的微血栓的形成在脓毒症所致的多器官功能障碍中发挥着重要作用。而血栓形成和炎症反应的交互影响推动了脓毒症中DIC的发生。

炎性小体活化在脓毒症DIC中发挥着重要作用。在动物实验中，最新研究发现，细菌的LPS可在高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)的辅助下通过caspase-11导致单核/巨噬细胞内GSDMD的裂解和细胞膜上纳米孔的形成，导致细胞的凋亡或细胞的高活性状态。这一过程一方面可以导致富含TF的微泡的释放，IL-1β、IL-18的成熟和释放，导致血液循环中TF的暴露增加，促进炎症反应[12]；另一方面，GSDMD纳米孔介导了Ca2+内流，导致Ca2+依赖的跨膜蛋白16F的活化，从而诱发细胞膜上PS的外化，暴露的PS可以增加TF的促凝活性[52]。由此可见，在脓毒症中，作为外源性凝血途径启动因子的TF的量及质都明显提高。研究发现，通过基因降低TF的表达或使用抗体抑制TF的活性能够有效预防脓毒症中DIC的发生，表明在脓毒症诱导的DIC中，TF介导的外源性凝血途径发挥了主要作用。此外最新的研究表明，在脓毒症中升高的促炎细胞因子1型干扰素具有促进HMGB1释放入血的作用，阻断1型干扰素的表达或者降低血液中的HMGB1能够有效减少LPS诱导的脓毒症DIC的发生[53]，在临床研究也肯定了HMGB1在DIC发生中的作用，研究发现HMGB1的水平与DIC评分和器官衰竭的严重程度相关，而抑制HMGB1可能使脓毒症患者受益[54]。

脓毒症中DIC发生的机制多样，除炎症小体相关通路外，NETs、组蛋白、DNA等也对于DIC的发生有着促进作用。这些研究也使我们认识到高凝/血栓形成与炎症反应间复杂的交互作用，为其治疗和预防提供新的思路和方向。

3.2子痫前期 子痫前期是一种以妊娠期高血压、蛋白尿为主要特征的严重的胎盘介导妊娠并发症，因其发病率高，死亡率高、妊娠结局不良等而受到广泛的关注。

关于子痫前期的发病机制，目前普遍认同的是两阶段学说，即第一阶段(胎盘异常阶段)：遗传、环境、免疫等因素导致子宫螺旋动脉重铸不良，进而引发胎盘灌注不良，功能障碍；第二阶段(母体综合征)：功能障碍的胎盘释放抗血管生成因子、促炎细胞因子，细胞源性微粒等促炎物质进入母体循环，导致广泛的血管内皮功能障碍以及血小板、炎症细胞的过度激活，功能障碍的内皮细胞、激活的血小板、炎症细胞进一步释放促炎物质入血，形成正反馈循环，最终引起母体的多器官功能障碍。从发病机制中可以明显发现，血栓炎症反应在子痫前期的进展中发挥着重要作用。相关研究也发现，参与血栓炎症反应的相关物质与子痫前期的发生发展密切相关，如血小板第4因子(platlet factor 4，PF4)，作为血小板活化的标志物之一，临床研究发现，子痫前期患者中PF4的浓度增加，妊娠前高浓度PF4与胎盘介导的不良妊娠结局风险增加相关[55]；子痫前期患者中中性粒细胞活化增加，NETs生成增加，血浆DNA水平升高，升高的血浆DNA水平与凝血功能增强呈正相关[56]；此外，研究发现子痫前期患者HMGB1水平较正常妊娠女性明显增加，除肝细胞释放HMGB1外，血小板活化亦可以释放HMGB1[57]。

血管内皮损伤是血栓炎症反应重要的调节者，子痫前期作为一种以血管内皮损伤为主的慢性炎症性疾病，其在高凝/血栓形成与炎症反应之间必然存在着复杂的交互作用。了解子痫前期中血栓炎症反应的分子机制，将对子痫前期的预防及治疗有着重要的临床意义。

3.3COVID-19 COVID-19是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的以血管炎症和内皮损伤为特征的系统性疾病。在患者体内其炎症反应水平升高，有明显的血栓形成倾向。重症监护室中的COVID-19患者发生血栓事件的比率高达17%～69%，有13%～35%被诊断为肺栓塞[58-59]。在尸检结果中可见肺上皮细胞的广泛性损伤，肺内小血管和毛细血管中存在大量微血栓[60]。患者体内的炎症反应水平明显升高，IL-1、IL-6、TNF-α、C反应蛋白等促炎物质明显增多[61]，血小板-单核细胞聚集体形成增加[62]。这些新冠肺炎患者的临床表现和实验室检查提示血栓炎症反应在新冠肺炎的进展中发挥了重要作用，而内皮细胞功能障碍可能是其过度的血栓炎症反应中的关键一环。

内皮细胞是血栓炎症反应重要的调节者。SARS-CoV-2通过刺突蛋白与广泛分布于肺泡Ⅱ型细胞和内皮细胞上的血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合，导致广泛的内皮细胞功能障碍，Dupont等[63]通过检测COVID-19重症患者中内皮细胞损伤标志物，如vWF：Ag、PAI-1、组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)、NETs等发现内皮细胞的损伤与COVID-19患者多器官功能衰竭相关。Krishnamachary等[64]研究发现COVID-19患者中微泡(富含促炎、促凝、免疫调节蛋白)的含量明显升高，且可用于区分轻度和重度患者。

血管内皮细胞在维持体内凝血与炎症的稳态中发挥着重要作用，COVID-19重症患者中伴随着明显的内皮细胞损伤，了解内皮细胞损伤的机制，将其应用于COVID-19的诊断、治疗中或许能够使患者受益。

4 血栓炎症反应相关标志物检测方法学

血栓炎症反应是高凝/血栓形成与炎症反应间复杂的相互影响，涉及复杂的分子机制及众多的标志物，选择合适的标志物进行检测，用以辅助临床的诊断和治疗具有重要的意义。

4.1HMGB1的检测 HMGB1作为促炎物质及血栓炎症反应重要的参与者，与多种血栓炎症反应相关疾病的分型与预后相关。ELISA是检测血清/血浆HMGB1的常用方法，其基本原理是依赖抗原抗体反应的特异性和酶促反应的专一性，使得底物显色程度与待测分子含量呈正相关。该种方法简单易行，便于临床应用。

4.2NETs的检测 NETs具有促炎、促凝、促血小板活化作用。ELISA和免疫荧光法是检测NETs常用的方法。免疫荧光术常选用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer，FITC)偶联抗人MPO抗体、抗组蛋白H4抗体、抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体进行标记，将LPS或佛波酯(PMA)刺激中性细胞产生NETs作为阳性对照。ELISA是利用抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体或抗MPO抗体作为捕获抗体，与NETs的蛋白质成分相结合从而将NETs固定于ELISA板上，用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的抗dsDNA 抗体作为检测抗体的检测方法。这两种方法相对简单，能在大多数实验室中进行操作[65]。

4.3血小板源性微粒的检测 血小板源性微粒常利用流式细胞术进行检测。常利用Annexin V和CD41a 标记血小板源性微粒，Annexin V 为总微粒的特异性标记物，CD41a为血小板源性微粒表面特异性标记物，利用标准化微珠设门，调节电压及补偿，进行血小板源性微粒的检测。

5 总结

高凝/血栓形成与炎症反应之间存在着复杂的交互关系。过度放大的血栓炎症反应能够导致多器官的损伤，特别是肺(如急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征)和肾(急性肾损伤)，这也是当下重症患者高死亡率的主要原因。进一步明确在特定疾病状态下的血栓炎症反应调节的分子机制，采用检验学方法辅助血栓炎症反应的早期干预，深入研究潜在的干预手段，对许多危急重症疾病的诊治具有重要的临床实践意义。