干细胞在糖尿病创面愈合中的应用进展

温作君，朱冰 ，孙杰，顾隆森

1 安吉县第三人民医院骨科，浙江湖州 313300；2 安吉县第三人民医院内分泌科，浙江湖州 313300

糖尿病是一种高发的代谢紊乱性疾病，其引起的神经、微血管和大血管病变以及免疫反应低下可导致创面愈合不良［1］。创面愈合困难经常因组织缺血或持续的压力而加剧，特别是在足部，如果没有得到适当的治疗，最终可导致截肢。研究表明，糖尿病足溃疡（DFU）的治疗成本是非 DFU 的十倍［2］，且DFU 的直接成本和患者 5 年生存率与癌症相当［3］。因此，探索改善糖尿病创面愈合的创新疗法有利于减轻该疾病对患者和社会的负担。近年越来越多的证据表明，干细胞疗法有利于组织再生和创面愈合［4］。现从干细胞类型、干细胞的给药途径和干细胞的操纵技术三个方面展开综述，为干细胞进一步应用于临床治疗糖尿病创面提供参考。

1 用于治疗糖尿病创面的干细胞类型

1.1 成体（成人）干细胞 间充质干细胞（MSC）是最常见的用于治疗的体细胞。MSC 是一种具有自我更新能力的多能干细胞，存在于骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和外周血等多种组织器官中［5］。在合适的条件下，MSC 可分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞；也可分化为其他细胞类型，如内皮细胞、角质细胞和皮肤附属细胞。更重要的是，MSC 是营养工厂，可产生各种各样的细胞因子和生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、血管生成素-1（Ang-1）和基质衍生因子-1（SDF-1）［6］。这些因子有助于不同阶段的创面愈合，其中一些因子还具有免疫调节功能，如增加抗炎因子IL-10、IL-4水平，降低TNF-α和IFN-γ水平［7］。这些因子还通过抗菌肽LL-37发挥抗菌作用，这对易感染的糖尿病创面非常有益［8］。因此，MSC是组织工程技术和皮肤再生细胞疗法的理想细胞。

MSC 具有免疫豁免特性，因此在多个同种异基因移植人体临床试验中显示出良好安全性。随机临床试验的荟萃分析表明，无论年龄大小或溃疡大小，自体干细胞均有助于治愈糖尿病溃疡［9］。骨髓间充质干细胞（BM-MSC）是一种具有转化前景的干细胞类型，适用于糖尿病创面的同种异体细胞和自体细胞治疗。目前，BM-MSC 是糖尿病创面临床前和临床研究的首选细胞类型［10］。这可能是由于其临床转化效果较好和安全性良好。然而，BM-MSC 的分离具有很强的侵袭性，目前正在寻找其他更易获得的替代来源，如脂肪、胎盘组织、脐带。

有趣的是，对干细胞治疗DFU 的文献进行综合分析发现，与临床前研究相比，临床研究中使用外周血干细胞的报道较多［10］。这种差异表明，更容易获得的自体成人干细胞来源（如血液和脂肪）将更有可能在临床上应用。基质血管组分（SVF）是成人基质/干细胞家族的新成员，是从脂肪组织提取出来的多种细胞的混合体，包括MSC、内皮祖细胞（EPC）、调节性T细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞（SMC）、周细胞和脂肪前体细胞。富含高水平EPC和MSC的SVF有助于新生血管再生。HAN 等［11］研究结果显示，SVF 可刺激糖尿病成纤维细胞的增殖和胶原合成，并缩短治愈时间，为DFU 提供一个简单和有效的治疗方法。最近一项临床研究表明，SVF可以通过促进血管修复和血管化方式安全地加速创面愈合［12］。由于SVF较易在手术室中收集和处理，其可以作为即时治疗方法。此外，SVF 可移植回患者体内，避免了昂贵的GMP 实验室处理。然而，目前SVF 临床应用仍存在困难，包括缺乏标准的提取方案（尤其是在机械处理和酶处理方面）、胶原酶消化成本高，以及加工过程中可能存在污染风险。尽管存在这些障碍，SVF作为一种术中细胞治疗方法，其应用前景是光明的。

1.2 诱导多能干细胞（iPSC） 尽管MSC 是一种有希望用于治疗目的的细胞类型，但它们并没有无限增殖能力，这限制了其在再生医学领域的应用。TAKAHASHI 等［13］于 2006 年成功研发 iPSC，他们将体细胞重新编程为多能干细胞，使其具有增殖能力和分化潜力，用于解决成人干细胞有限的问题。成年体细胞通过病毒或非病毒递送系统诱导四种转录因子（通常为Oct4/Sox2/KLF4/cMyc 或Oct4/Sox2/NANOG/LIN28）的表达，可重编程为 iPSC。iPSC 最大的优点是其无限分化为各种靶细胞的能力，可用于创面愈合的治疗。此外，应用iPSC 还可避免胚胎干细胞（ESC）面临的伦理问题。

越来越多研究发现iPSC 具有强大的治疗潜力。KASHPUR 等［14］将 iPSC 衍生的成纤维细胞接种到3D 组织上，发现其可以长入糖尿病创面并促进创面愈合，表明iPSC 具有治疗DFU 的潜力。最近，GORECKA 等［15］发现，在糖尿病小鼠模型中，将新生儿成纤维细胞的iPSC 分化为SMC（实验组）并经胶原基质进行输送，可加速小鼠创面愈合和创面床的新生血管生成。与对照组脂肪来源的MSC（ADSC）相比，实验组SMC 在植入后7 d 仍存在于创面床上，并分泌更高水平的促血管生成细胞因子，加速创面闭合。此外，实验组创面区域促炎症相关的M1 型巨噬细胞数量减少，促再生作用的M2 型巨噬细胞数量增加。ITOH 等［16］将来源于健康者和隐性营养不良性大疱性表皮松解症患者皮肤的iPSC 诱导分化为功能性真皮成纤维细胞和角质细胞，并移植到3D 皮肤模型中用于创面治疗［17］。另外一项研究使用人iPSC 分化的SMC 治疗下肢缺血模型小鼠，小鼠下肢缺血状况显著改善［18］。上述这些研究表明iPSC是治疗创面的理想细胞类型之一。

由于真皮层高度血管化，血液供应不良的慢性糖尿病创面使用常规方法愈合不佳。因此，优化创面部位的新生血管生成是另一个至关重要的治疗目标。MSC与内皮细胞或EPC的共培养为快速微血管组装提供了必要的原材料，进而增强血管连接。然而，内皮细胞具有高度的免疫原性，因此不可能仅依赖同种异体来源的这些细胞，使用自体iPSC衍生的内皮细胞可以解决这一难题。ABACI等［19］利用iPSC衍生的内皮细胞结合新型3D生物打印技术成功创建血管网络，并在小鼠模型中成功验证。SHEN等［20］使用来自1型糖尿病患者和健康者的iPSC内皮细胞生成带血管的皮肤结构，植入后3 d内可实现宿主血管灌注。这种联合组织工程技术有利于制造个性化的血管化皮肤。

尽管干细胞疗法（包括MSC和iPSC）前景光明，但细胞表型变异可在不同的个体间发生，甚至在同一个体上发生，通常难以确定其总体疗效。此外，存在一些安全问题，如培养过程中的潜在致突变性以及植入后未分化细胞的潜在致瘤性。未来需要进一步改进体细胞诱导技术，以实现更严格、更可靠的iPSC表型分析。

2 治疗糖尿病创面干细胞的给药途径

目前，虽然有一些方法可以将干细胞运送到感兴趣的部位，但由于缺乏标准化，很难对比它们的疗效。由于糖尿病是全身性疾病，通过全身或局部注射干细胞治疗糖尿病创面均是有益的。

全身给药即将干细胞直接注射到血液循环中或肌肉中。干细胞全身给药有助于缓解糖尿病的一些全身并发症，例如使用脂肪来源的MSC或iPSC-SMC对肢体缺血进行血运重建，从而改善整体愈合环境［18，21］。值得注意的是，在静脉输注MSC时，大部分MSC 被困于肺部，这使得MSC 在给药后体内存留时间短暂［22］。因此，避免细胞被困于肺部可能会提高循环MSC 的存活率。采用动脉注射，如通过股动脉、颈动脉、左心室或肾动脉，可以避免这个问题［23］。虽然动脉给药有利于MSC 靶向器官，但这种途径增加了侵袭性和并发症的风险。

虽然局部注射干细胞治疗创面较简单，但是存在细胞植入不良情形。一项研究显示，局部注射BM-MSC 至创面后，第28 天仅检测到2.5%的原始细胞［24］。为了改善植入效果，可在创面部位使用细胞基质载体进行局部给药。包含生物材料的支架一方面将干细胞输送到需要再生的区域，另一方面直接促进创面愈合。研究发现，水凝胶和聚合物支架可诱导和维持MSC 活性，从而促进血管生成、免疫调节、基质重塑和再生细胞因子的产生［25-26］。

单细胞转录组学有助于识别供体干细胞的再生潜力，以及通过使用亚群标记物潜在地帮助筛选和减少临床使用干细胞的供体变异性。KHONG等［27］研究发现，与衰老BM-MSC 相比，年轻BM-MSC 含有较高比例的高表达组织再生相关基因细胞，有利于加速创面愈合。此外，使用单细胞转录组学可以识别创面不同空间区域的基因表达差异，有利于特异性治疗创面，加速创面愈合。因此，利用单细胞转录组学辅助局部或全身个性化治疗创面具有广泛应用前景。

3 治疗糖尿病创面干细胞的操纵技术

通过干细胞操纵可以帮助宿主细胞归巢至创面部位，主要包括增加循环干细胞、增强细胞与创面部位的结合、促进干细胞分化为目标细胞以及增加血管生成。到目前为止，促进创面的新生血管生成是创面愈合的最重要目标，因为它是促进创面愈合过程的限制因素。以下讨论了为实现这一目标而在干细胞操纵方面取得的各种进展。

3.1 支架微环境 支架基质可用于操纵干细胞微环境，以增强其促再生能力。DASH 等［28］研究发现，支架胶原纤维密度可通过调节iPSC-SMC 的分泌功能提高细胞的再生能力。密集的纤维状胶原可增加促愈合细胞因子产生，如VEGF、IL-8、IL-10、TGF-β和角质形成细胞生长因子（KGF），以及增加内皮细胞增殖和迁移。应用生物活性聚合物对支架进行表面修饰也会影响干细胞的行为。例如，添加层粘连蛋白和透明质酸可提高细胞存活率，并促进种植细胞产生VEGF［29］。此外，支架微环境中的分子间键通过物理作用调节细胞增殖和分化。例如，MSC 在不同硬度（0.1~25 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶中培养，可分化为神经元、成肌细胞或成骨细胞；“较软”基质（0.1~1 kPa）有利于分化为神经源性细胞，而“较硬”基质（8~17 kPa）有利于分化为肌源性细胞［30］。纳米技术的最新进展也强调了支架物理性质的重要性，例如通过调节孔隙率来操纵细胞命运，进而加速创面愈合［31］。因此，改变基质的机械性质有助于植入的干细胞感知机械环境因素，从而促进细胞迁移和分化，加速不同阶段创面愈合。

3.2 缺氧预处理 细胞缺氧预处理可增强MSC 促血管生成能力，进而促进创面愈合。ROSOVA 等［32］提出细胞在移植前需进行缺氧预处理细胞步骤，使细胞在移植到具有严重缺氧的体内环境时能够抵抗凋亡刺激，例如慢性创面或其他损伤部位的缺血组织。MSC 缺氧预处理的另一个优点是保持细胞干性和多能性，这对需要组织再生的区域非常有益。

3.3 基因改造 干细胞也可以通过基因改造来提高其再生和治疗潜力。iPSC的使用为进一步的基因改造创造了机会，以纠正基因缺陷。TEO等［33］提出应用ZFN、TALEN、CRISPR 等技术体外修复与糖尿病相关的突变基因序列，然后再移植回糖尿病患者。从基因上纠正老年糖尿病患者的iPSC，去除与糖尿病、衰老相关的缺陷基因，增强自体细胞治疗效果。SONG 等［34］研究发现，通过慢病毒转染方式将v-Myc导入人ADSC中，可促进VEGF的分泌和体外血管生成。FIERRO等［35］的临床前研究也证实，在小鼠下肢缺血模型中，使用慢病毒载体可以安全地对MSC 进行基因改造，以产生高水平的VEGF，促进血管生成。

3.4 纳米技术 纳米技术可以增强干细胞潜能和分化能力。脂肪干细胞植入至光敏和仿生核壳纳米纤维支架后，在光刺激下可分化为表皮角质形成细胞［36］。纳米颗粒也可用于将遗传物质输送到细胞。YANG等［37］发明了一种非病毒、可生物降解的聚合物纳米颗粒，可将VEGF基因传递给MSC和ESC来源的细胞；经处理的干细胞显著增强了VEGF的生成能力、细胞活力和结合靶组织的能力。在小鼠下肢缺血模型中进一步证实，经生物降解聚合物纳米颗粒向MSC转入VEGF基因组的血管密度显著高于对照组，同时肌肉退化和组织纤维化减少。这些结果表明，基于生物降解聚合物纳米颗粒的工程干细胞是缺血性疾病的有效治疗手段，并显示出治疗创面的潜力。

3.5 分泌体组织工程 MSC 通过分泌一些营养物质（分泌体），发挥旁分泌效应，促进移植细胞的治疗效果。分泌体由可溶性因子（如细胞因子、趋化因子和生长因子）以及不溶性胞外囊泡（EV）组成。最新研究表明，与MSC 相似，iPSC 也通过旁分泌效应促进创面愈合，而不是直接的细胞相互作用。

越来越多的研究聚焦于如何利用细胞上清液中的分泌体，尤其是从不溶性EV 分离出的可溶性因子。EV 含有来源于细胞的核酸、蛋白质和脂质，并作为细胞内相互作用的重要介质，比可溶性分泌体更重要［38］。局部微环境可影响EV 的产生，细胞密度、细胞年龄、培养系统几何形状、缺氧和机械应力等参数也会影响EV转运和下游治疗效果［39］。因此，可在体外已知促进创面愈合的微环境中探索EV。

许多研究表明，不同细胞来源的EV 均可通过促进胶原合成和血管生成，进而促进皮肤创面愈合［40-42］。此外，EV 也被作为生物活性分子装载到组织工程支架上用于创面愈合。TAO 等［43］成功构建miR-126-3p 过表达滑膜MSC 控释外泌体复合壳聚糖基质支架，该支架通过增强再上皮化、血管生成和胶原生成，加速糖尿病大鼠创面愈合。WANG 等［44］设计了一种抗菌多功能FHE 水凝胶（F127/OHAEPL），其可控制释放来自ADSC 的外泌体。一项关于MSC-EV 促进糖尿病创面愈合的临床前文献荟萃分析发现，富含非编码RNA或微小RNA的EV，对糖尿病创面的愈合有显著影响，在血管密度和数量、疤痕宽度和再上皮化等方面也有积极的改善作用［45］。这些研究结果有利于推动MSC-EV的临床转化。

与基于细胞的治疗相比，EV的优势在于能够良好地修饰治疗材料，从而在体内产生可预测的剂量反应效应。此外，EV 也可以长期存储而不丧失功能。因此，EV是一种非常有潜力的创面治疗非细胞替代品，避免了单独使用干细胞或与干细胞联合使用的潜在并发症和风险。

4 总结与展望

SVF 和iPSC 是治疗糖尿病创面的潜在细胞疗法，SVF 具有即时使用特性，而iPSC 具有伦理问题少和来源丰富的优势，这使得它们非常适合用于难以治愈的慢性创面和复杂组织损伤。在给药途径方面，全身或局部注射干细胞治疗糖尿病创面均是有效方式，单细胞转录组学有助于干细胞给药途径更加个性化，加速创面愈合。在干细胞的操纵技术方面，多种技术从不同角度均可操纵干细胞，直接或间接增强移植细胞的功能，以促进创面愈合。其中，分泌体是一种很有前途的非细胞治疗策略，可以在难以愈合的慢性糖尿病创面中实现创面愈合，越来越多的难治性疾病可能受益于此类治疗方法。未来仍需进一步研究，解析干细胞疗法的确切机制，评估此类疗法的临床安全性，并专注于创新和临床转化。

利益冲突所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明温作君：论文撰写及文献资料的收集分析；朱冰：文献资料的收集，指导写作；孙杰，顾隆森：论文审核及修正，指导写作