蛋白桑组织培养探究

崔吉浩　高世庆　宗宪春

蛋白桑组织培养探究

崔吉浩高世庆宗宪春

（牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157011）

本研究以蛋白桑带腋芽的茎段为实验材料，进行蛋白桑再生体系的建立。结果显示，蛋白桑茎段适宜消毒组合为75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌发率达89.47%，但污染率24%；不定芽增殖方面，适宜培养基为MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系数达到4.50；在生根培养方面，蛋白桑适宜生根培养基为MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均为96%，但从节约成本上看，更适宜的生根培养基为1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在炼苗移栽方面，炼苗最佳天数为4 d，成活率达到88%。

蛋白桑；组织培养；植株再生

蛋白桑，别名饲料桑，也叫雅津蛋白桑，是1998年北京桑梁技术发展中心科学家从全国28个桑树品种中优选培育出的杂交优势桑，其是一种适合我国南北方栽培，高产、高效、高蛋白的优质桑科树种[1-2]。蛋白桑具有很高的经济价值、生态价值以及药用价值。蛋白桑是优良的畜禽饲料，在反刍动物的饲草料的配制研究方面具有很高的潜在价值[3]。本研究以蛋白桑茎段作为实验材料，探究不同浓度配比的MS培养基及不同植物生长调节剂对蛋白桑茎段不定芽增殖的影响，以及不同激素浓度的培养基中不定芽生根的差异，并分析炼苗时间对蛋白桑移栽驯化的影响，从中筛选出适宜蛋白桑茎段不定芽增殖和生根的培养基方案，为蛋白桑快速繁殖和种质资源保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验原材料为蛋白桑种子，由牡丹江师范学院提供，播种生长成植株后，取带腋芽的茎段进行组织培养实验。

1.2 方法

1.2.1 外植体的培养

选取饱满、无损伤的蛋白桑种子，先用50 ℃左右的温水浸泡种子，然后自然冷却到室温，浸种24 h后播种到花盆中，室温下培养，待长成植株后备用。

1.2.2 外植体的消毒

截取蛋白桑生长健壮的一年生枝条的中上部，用自来水冲洗1 h后将其剪成1 cm～2 cm的茎段（每个小段至少带有一个芽点），置于超净工作台。先用75%的乙醇消毒20 s，然后用无菌水冲洗4次～5次，再用0.2%的升汞设置不同的时间（5 min、7 min、9 min）进行消毒，最后用无菌水冲洗4次～5次。将消毒后的茎段置于带有滤纸已灭菌的培养皿中，吸收完多余水分后，接种于MS培养基中。每个消毒处理接种10瓶，每瓶接种5个茎段，重复3次。15 d后观察并统计萌发率和污染率，公式如下：

污染率＝接种污染数/接种总数×100%

萌发率＝芽点萌发个数/（接种芽点的总个数－污染的芽点个数）×100%

1.2.3 不定芽的增殖

截取带有腋芽的茎段，在不同植物激素浓度的MS培养基（见表2）中进行接种，每种培养基接种10瓶，每瓶接种3个，重复3次。30 d后观察不同激素浓度的培养基中不定芽的增殖情况，统计并计算增殖系数，公式如下：

增殖系数＝高于0.5 cm的苗总数/接种数×100%

1.2.4 生根培养

选择长至2 cm～3 cm且生长良好的不定芽，在无菌条件下进行剪切，将其接种到不同浓度植物激素配比的培养基（见表3）中。每种培养基接种50瓶，每瓶接种1个，15 d以后观察统计生根情况，并计算生根率，公式如下：

生根率＝形成根的芽数/接种的芽总数×100%

1.2.5 炼苗和移栽

生根15 d后，选择长势良好且根系发育较好的植株，打开培养瓶封口膜，分别炼苗0 d、2 d、4 d和6 d。炼苗后从无菌瓶中取出植株，冲洗干净培养基，移栽到盛有灭菌土的花盆中，室温下培养，观察20 d，记录生长情况。

1.2.6 培养条件

以上培养基中均添加30 g蔗糖、6 g琼脂，pH值调至5.8，分装后在121 ℃的湿热环境中灭菌20 min，室温冷却备用。接种后，培养瓶置于温度（25±2）℃，光照强度2 000 lx～2 500 lx，光照时间14 h/d的条件下培养。

1.2.7 数据的统计分析

实验中测定的基础数据用Excel软件处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对蛋白桑茎段的影响

经过不同的消毒时间处理，培养15 d后蛋白桑茎段的萌发和污染情况如表1所示。从表中数据可以看出，用75%乙醇和升汞对蛋白桑茎段进行消毒处理，不同的消毒时间影响蛋白桑不定芽的萌发。其中，75%乙醇消毒20 s＋升汞消毒7 min的萌发率最高，为89.47%，但污染率达24%。75%的乙醇消毒时间一定，随着升汞消毒时间延长至9 min，污染率降低，仅为16%，但芽点萌发个数以及萌发率下降，萌发个数为72个，萌发率仅为57.14%，可能是升汞的处理时间过长，对幼嫩的外植体产生的伤害较大，对外植体的表面保护层及芽点生长处造成了破坏。

表1不同消毒时间下蛋白桑茎段的萌发和污染情况

编号溶液及处理时间接种个数污染个数污染率/%萌发个数萌发率/% 75%乙醇/s氯化汞/min M120515039269686.49 M2207150362410289.47 M320915024167257.14

2.2 蛋白桑的不定芽增殖

不同激素浓度配比的培养基中，不定芽增殖情况如表2所示。由表2可以看出，仅添加3 mg/L 6-BA（细胞分裂素）的培养基（CB6）中，不定芽增殖效果最好，增值系数达4.50。

表2不同植物激素组合中不定芽的增殖情况

编号激素种类及用量接种个数增殖个数增殖系数 6-BA/mg/LKT/mg/L CBK111901171.30 CBK21.51.5901261.40 CK302901301.45 CK403901261.40 CB520902923.25 CB630904054.50

2.3 蛋白桑的生根培养

不同浓度NAA和MS配比的培养基中，培养15 d后不定芽生根情况如表3所示。

表3生根培养基的配方及生根率

编号培养基组成生根率/% CS1MS＋0.1 mg/LNAA96 CS2MS＋0.2 mg/LNAA95 CS3MS＋0.3 mg/LNAA88 CS41/2 MS＋0.1 mg/LNAA96 CS51/2 MS＋0.2 mg/LNAA94 CS61/2 MS＋0.3 mg/LNAA92

一般无菌芽接种15 d后即可生根，而培养基中添加植物激素，对生根影响显著。由表3可知，MS培养基中添加NAA浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L时，生根率分别为96%和95%，且根系粗壮、数量较多。1/2 MS培养基中添加NAA浓度为0.1 mg/L和0.2 mg/L时，生根率分别为96%和94%，根系粗壮、数量多。从节约成本的角度考虑，1/2 MS＋0.1 mg/LNAA组合的培养基（CS4）更适宜作为蛋白桑生根培养基方案。

同时观察发现，生根期间根部均出现不同程度的褐化，可能是桑树自身分泌物导致，但其对根的生长几乎没有影响。

2.4 蛋白桑的炼苗移栽

蛋白桑生根培养15 d后，打开培养瓶封口膜，炼苗4 d，然后进行移栽，蛋白桑幼苗生长茁壮，成活率最高，达88%。炼苗2 d后进行移栽，蛋白桑幼苗叶片少许发黄，生长较慢。炼苗6 d后进行移栽，幼苗叶片蜷缩，枯萎现象较为严重，死亡过半。而未进行炼苗的蛋白桑移栽至花盆后，枯萎现象严重，最终全部死亡。因此，蛋白桑适宜炼苗时间为4 d，幼苗长势较好。

3 讨论

3.1 植物组织培养中出现的污染问题

进行植物组织培养时，材料带菌、操作不规范以及其他不利的环境因素，均会导致污染情况的发生[4]。细菌污染的主要特征是实验材料表面产生黏液状物质，或是浑浊的水迹状物质，应注意彻底消毒实验用具。常见的真菌污染有曲霉属、镰刀霉属以及青霉属等的真菌，防治真菌污染时，常用的杀菌剂种类较多，如酒精、氯化汞、次氯酸、漂白粉等[4]。杀菌剂可以有效地杀死植物组织表面带有的真菌，但其要易漂洗或自行分解，如果出现残留，将会对植物组织产生毒害作用[5]。此外，定期对超净工作台等相关仪器进行消毒及规范无菌操作很有必要。

秦新慧等[6]（2016）在沙地蛋白桑高效组培快繁体系的建立中，对实验材料进行消毒时，使用75%的乙醇消毒20 s，然后用浓度0.1%的氯化汞溶液消毒8 min，污染率为28%。本实验使用浓度为75%的乙醇和0.2%的升汞作为消毒剂，采用不同的消毒时间，筛选出蛋白桑茎段适宜的消毒时间组合为75%乙醇20 s＋升汞7 min，污染率为24%。

3.2 植物激素对芽增殖的影响

植物激素是通过微小剂量便能够围绕植物的生长发育开展相应调控的生物活性物质[7]，其作为植物体内的特殊信息传输载体，即便含量不高，也能显著影响植物体的生长和繁殖[8]。不同种类的激素组合，不同的浓度配比，对植物体的不定芽再生产生不同影响。现在普遍使用的植物激素有6-BA、NAA、KT、ZT、2,4-D等。陈权等（2021）在不定芽增殖中使用浓度为3.0 mg/L的6-BA，增殖速度快，增殖系数为2.65[9]。刘明辉等（2003）通过研究得出，细胞分裂素6-BA可能是桑树不定芽增殖的必需物质[10]。本实验中，与陈权等[9]（2021）的分析结果一致，使用3.0 mg/L的6-BA不定芽增殖效果最好；采用不同的激素组合来分析其对诱导芽增殖的影响，可以发现6-BA浓度是诱导芽增殖的关键，与刘明辉等[10]（2003）的结论一致。

4 结论

本研究通过蛋白桑再生体系的建立，得到蛋白桑茎段适宜消毒组合为75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌发率89.47%，污染率24%；不定芽增殖方面，适宜培养基为MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系数达到4.50；此外，蛋白桑适宜生根培养基为MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均为96%，但从节约成本的角度考虑，更适宜的生根培养基为1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在炼苗移栽方面，炼苗适宜天数为4 d，成活率高达88%。

[1]BETTELHEIM K A.Role of non-O157 VTEC[J].Symp Ser Soc Appl Microbiol,2000(29):38S-50S.

[2]FURLAN J P R,GALLO I F L,DE CAMPOS A C L P,et al.Characterization of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) obtained from feces of sheep in Brazil[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2019,35:134.

[3]KARMALI M A.Factors in the emergence of serious human infections associated with highly pathogenic strains of shiga toxin-producing Escherichia coli[J].Int J Med Microbiol,2018,308(8):1067-1072.

[4]王朝雯.植物组织培养的污染及防治措施[J].农村经济与科技,2020,3(8):29,35.

[5]高弘扬,许丹芸,周良云,等.试管苗玻璃化现象的研究进展[J].现代农业科技,2019(20):52-56,59.

[6]秦新慧,崔兴林,武兴宝,等.沙地蛋白桑高效组培快繁体系的建立[J].经济林研究,2016,34(3):169-174.

[7]岳川,曾建明,章志芳,等.茶树中植物激素研究进展[J].茶叶科学,2012,32(5):382-392.

[8]曾勤飞,熊洋凤.植物学中的植物激素分析[J].花炮科技与市场,2019(4):281-282.

[9]陈权,陈慧兰,张承妹,等.大花葱愈伤组织诱导分化及不定芽增殖研究[J].上海农业科技,2021(3):71-73.

[10]刘明辉,王国忠,徐家萍.桑树冬芽组织培养品种效应研究[J].中国蚕业,2003,24(1):19-20.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.04.03

S888

A

2095-1205(2022)04-07-03

黑龙江省教育厅项目（20200177）

崔吉浩（1996- ），男，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，研究方向为遗传育种与生物技术。

宗宪春（1966- ），女，山东金乡人，博士，教授，研究方向为遗传育种与生物技术。