基于BSMV 病毒载体的作物内源miRNA 功能研究

焦 健，沙小晶

（中国科学院科技战略咨询研究院，北京 100190）

一、作物miRNA 的生物信息学预测

利用生物信息学的途径预测并发现新的miRNA 是一种有效方法，它以计算机程序分析为基础、以给定的基因组序列为范围，在动植物中鉴定出许多miRNA[1]。此方法可以鉴定那些表达量低或有时空表达特性的miRNA，利用miRNA 前体的二级结构特征、热力学稳定性和物种间的相对保守性，寻找同源miRNA。

植物miRNA 的生物信息学预测方法有同源性比对、与靶标基因相结合、模式学习等方法[2]。同源性比对是根据同源miRNA在物种间的相对保守性和pre-miRNA 前体的结构特征来搜索miRNA。利用miRNA 与其靶标基因可以发生碱基互补配对的特点，以及该配对方式也具有保守性，可以结合miRNA 的靶标基因，作为预测中的一个筛选条件，这种与靶标基因相结合来预测miRNA 的方法进一步提高了预测的准确性。模式学习是预先训练计算机程序对已知阳性miRNA 数据集和阴性miRNA 数据集的识别，进而对未知数据集进行分析的技术手段，该方法通过区分miRNA 和非miRNA 的天然特点，成为预测新miRNA 的一种途径。

根据以上预测方法的基本原理，出现了系列miRNA 及其靶标基因的预测软件，如：miRanda、DIANA-microT、RNAhybrid、TargetScan、MicroInspector、PicTar、TargetBoost、miTarget、RNA22 和microTar 等[3]。这些程序或预测软件各有优缺点，还需其他方法加以佐证才能真正鉴定新的miRNA。

二、作物miRNA 的高通量测序法

近年来，第二代测序法即高通量测序法被广泛应用于植物siRNA 或miRNA 的测序和鉴定，客观上加快了siRNA 和miRNA研究进展，使大规模克隆sRNA 并分析它们的功能成为可能。

高通量测序法具有高通量、高灵敏度、杂交特异性好等优点。该方法首先需提取植物组织的Total RNA，用高密度聚丙烯酰胺凝胶电泳回收长度为18～30 nt 的sRNA，将得到的sRNA 5’和3’端加特异的接头adaptor，经过反转录和PCR 级联扩增，建立富含18～30 nt的sRNA 文库，再高通量上机测序得到大量初始数据。通过对这些初始数据的比对、分析和鉴定，可以获得相当可观的信息。

目前，通过高通量测序法建立的miRNA 数据库有：GEO（Gene Expression Ommibus）、miRBase、ASRP（Arabidopsis Small RNA Project）、Rfam、MPSS（Massively Parallel Signature Sequencing）和TarBase 数据库等[4]。

三、作物miRNA 靶标基因的鉴定和研究

miRNA 靶标基因的鉴定并进而对其的功能分析，是研究miRNA 生物学功能的重要环节[5]。由于miRNA 可以与其靶标基因互补配对，因此，可以较方便的利用生物信息学方法，比对miRNA 所在的物种基因组全序列或部分ESTs 数据库，就能对miRNA 的靶标基因进行初步预测。

初步预测得到的候选miRNA 靶标基因，还需通过其他试验方法加以验证，最终结合多种miRNA 靶标基因鉴定的方法，可以确定一个miRNA 的一个或多个靶标基因。其中，5’RACE 方法可以在转录水平鉴定miRNA 对其靶标基因的切割降解，通过5’RACE 却不能扩增到的候选基因，即为miRNA 的靶标基因。

Western bloting 方法可以在翻译水平鉴定miRNA 对其靶标基因翻译的抑制，Western 杂交后目的蛋白条带不清晰或没有蛋白条带的候选基因，即为miRNA 的靶标基因。

利用Northern bloting 方法可以检测靶标基因的降解片段，从而在体外验证miRNA 对靶标基因的切割降解。

通过对miRNA 靶标基因的预测和各种鉴定后，对其功能分析也可以间接证明内源miRNA 的功能，因此，miRNA 靶标基因的鉴定和研究对分析miRNA 功能和作用具有重要意义[6]。

四、miRNA 研究案例

1、植株材料

大麦材料：I10；小麦材料：中国春；其他植株材料：本生烟、拟南芥、短柄草等。

2、载体和菌株

VIGS 相关的病毒载体包括：BSMV-LIC 载体（α,β 和γ 均为DNA 质粒）。

表达载体包括：pGreen 载体，用于内源siRNA 或miRNA 在本生烟中高表达。

克隆载体包括：pEASY-T、Gateway 相关载体。

大肠杆菌菌株包括：DH5α 和DH10B；农杆菌菌株包括：GV3101 和EHA105。

3、BSMV pCaBS-γ-LIC 载体的构建

用于内源基因沉默：PCR 扩增目的片段时（最优片段大小约为200-400bp），正向引物5’端需加LIC 接头的序列为：5’-AAGGAAGTTTAA-3’，反向引物5’端需加LIC 接头的序列为：5’-AACCACCACCACCGT-3’。

操作流程：PCR 扩增带有LIC 接头的目的片断；将pCaBSγ-LIC 载体用ApaI 完全酶切，并依照以下流程将目的片段与载体用LIC 克隆方法连接：

若将携带amiRNA 的miRNA 前体序列插入BSMV pCaBS-γ-LIC载体，需要利用多重PCR，用amiRNA 和amiRNA*序列替换内源的miRNA 和miRNA*序列，并保持原miRNA 前体二级茎环结构不变。

4、结果与分析

目前，越来越多的miRNA 通过测序或生物信息学预测的手段被报道，而仅有其中少数被研究透彻。通过表达和沉默miRNA是广泛使用的反向遗传学策略，为验证BSMV 表达miRNA 前体而产生vamiRNA 或“与miRNA 序列相同的sRNA”（以vsiRNA表示）能否用于研究麦类作物内源miRNA 的功能，可利用BSMV 病毒载体在麦类作物和模式植物短柄草中表达miRNA 前体以产生vsiRNA，或利用vamiRNA 沉默内源miRNA。

（1）构建基于BSMV 的vsiR_miRNA 表达载体

在大麦品种I10 中分别过表达HvuMIR164 和HuvMIR171 前体（以下用BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 表示），利用半定量End-point Stem-loop RT-PCR 检测到内源miR164 或miR171均有显著上调，这可能是vsiR_miR164或vsiR_miR171高表达的结果。

（2）构建基于BSMV 的miRNA 沉默载体

通过WMD3 平台，设计靶向内源miR164 和miR171 区域的amiRNAs 序列，即vamiR_miR164 和vamiR_miR171，再利用水稻OsaMIR528 前体作为骨架携带它们，通过BSMV 在I10 中表达（以下用BSMV：vamiR_miR164和BSMV：vamiR_miR171表示）。

半定量RT-PCR 检测结果表明，BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中，miR164 或miR171 的相对表达量显著低于BSMV：EV 处理的植株，并且BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中检测到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的高表达，而对照BSMV：EV 处理的植株未检测到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的表达。

结果说明，基于BSMV 的miRNA 前体或vamiRNA 的表达系统可在大麦中表达与miRNA 序列相同的sRNA（即vsiRNA）或沉默内源miRNA，这为研究麦类作物内源miRNA 的功能提供了一种研究手段。

（3）基于BSMV 的miRNA 表达或沉默在小麦和短柄草中的验证

试验进一步证明，BSMV 病毒载体也可以在普通小麦和模式植物短柄草中实现对内源miRNA 的沉默或表达与miRNA序列相同的sRNA。QRT-PCR结合End-point Stem-loop技术检测结果表明，与对照BSMV：EV 处理的植株相比，BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 处理后，大、小麦和短柄草vsiR_miR164 和vsiR_miR171 表达量显著上升；而BSMV：vamiR_miR164 和BSMV：vamiR_miR171 处理后，大、小麦和短柄草内源miR164 和miR171 表达量显著下降。

半定量PCR 检测BSMV 在大麦中高表达vsiR_miR164和vsiR_miR171。半定量PCR 检测BSMV 在大麦中沉默内源miR164 和miR171。QRT-PCR 检测BSMV 在麦类作物和短柄草中vsiR_miR164 或vsiR_miR171 的表达变化。

5、结论与讨论

研究内源miRNA 的功能，首先，要获得miRNA 序列，这可以通过生物信息学预测、高通量测序或直接克隆得到。其次，要研究miRNA 的功能，过表达和沉默是研究内源miRNA 功能的重要技术手段，可以借助于miRNA 高表达载体在植物中瞬时或稳定的高表达内源miRNA，也可以通过amiRNA 技术和miRNA target mimic 技术沉默内源miRNA。此外，通过生物信息学方法预测内源miRNA 的靶标基因，对其靶标基因的功能分析也可以间接证明内源miRNA 的功能。

本研究发现，在麦类作物和短柄草植物中，BSMV 病毒载体可通过表达内源miRNAs 的前体以过表达与miRNA 序列相同的sRNAs（即vsiRNAs）或表达适当的vamiRNAs 以沉默相应的内源miRNAs。或许，BSMV 病毒载体还可以结合STTM 技术，或将实现对内源miRNAs 的沉默。总体来看，这使得鉴定麦类作物和模式植物短柄草内源miRNAs 的靶标基因成为可能。