茖葱愈伤组织诱导与再分化培养基筛选

程广有，唐晓杰，林 蔚

(北华大学林学院，吉林 吉林 132013)

茖葱(AlliumvictorialisL.)为百合科葱属草本植物，广泛分布于北温带[1-2].茖葱药食同源，幼芽、茎叶、花蕾都可以食用.茖葱茎叶中富含Fe、Mn、Sr、Ba、Zn、B等微量元素，具有很高的营养价值[3-6].茖葱具有止血、消炎、消肿、去痛功效，能够提高人体免疫机能，治疗感冒、咳嗽和上呼吸道疾病，降低胆固醇、降血脂和预防癌症，被誉为 “菜中灵芝”[3，7-12].

茖葱种子深度休眠，播种后隔年出苗[13-15].茖葱实生苗5 a左右开始分蘖，分株繁殖在移栽后第3年植株开始分蘖，因此，分株繁殖十分困难[16].茖葱种子休眠期长，播种不易出苗，分株繁殖系数低.同时，由于人工过度采挖，导致野生茖葱数量越来越少，而人工栽培刚刚起步，市场供不应求.利用组织培养技术可以实现茖葱快速繁殖，并且能够克服实生繁殖导致的遗传分化现象，完整保存原来植株的优良性状[17-18].目前，茖葱组培繁殖的相关报道较少，繁殖系数低的问题尚未解决.本文从愈伤组织诱导、植株再生等方面进行探讨，为实现茖葱工厂化快速繁殖提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材 料

2019年6月，从茖葱栽培基地挖取植株，剪掉叶片和根系，剥去表层鳞片，取鳞茎中央的鳞片作为外植体.

1.2 方 法

1.2.1 外植体灭菌

先用自来水加洗洁精清洗茖葱鳞片，在超净工作台内，把清洗好的鳞片放入70%的乙醇水溶液中浸泡30 s，再转移到0.1%氯化汞(HgCl2)溶液中浸泡，浸泡时间分别为5、7、9、12 min，浸泡期间搅拌3～5次，灭菌后用无菌水冲洗鳞片5次，切成0.5～1.0 cm小块，备用.

1.2.2 培养基制备

1)基本培养基.在MS、White和WPM 3种基本培养基中均加入6-苄基-氨基-腺嘌呤(6-BA)1.0 mg/L和萘乙酸(NAA)0.3 mg/L.

2)愈伤组织诱导培养基.在MS培养基中分别加入不同质量分数的6-BA与2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或NAA组合.

3)不定芽诱导培养基.在MS培养基中分别加入不同质量分数的6-BA和NAA.

4)壮苗培养基.MS培养基.

5)不定根诱导培养基.在1/2MS培养基中分别加入不同质量分数的NAA和6-BA.

1.3 移栽基质

松针土、旱田土和草甸土.

1.4 培养条件

培养温度24～26 ℃，光照强度2 000～3 000 lx，光照时间12～14 h/d.

2 结果与分析

2.1 灭菌时间

利用0.1%HgCl2对茖葱鳞片进行表面灭菌，灭菌后用无菌水冲洗5次，接种到初代培养基中.在25 ℃条件下培养15 d，观察污染率与死亡率.结果显示，氯化汞灭菌时间越长，污染率越低.灭菌12 min无污染，但由于灭菌时间过长会导致小块茖葱鳞片死亡，没有愈伤组织形成；灭菌9 min基本无污染，外植体被杀死的数量较少(表1).由此表明，0.1%HgCl2水溶液浸泡9 min是茖葱鳞片的适宜灭菌时间.

表1 灭菌时间与外植体污染率

2.2 基本培养基筛选

不同植物对营养成分的种类和数量需求不同.将茖葱鳞片分别接种到MS、White和WPM基本培养基中离体培养，诱导愈伤组织，培养3周后调查愈伤组织发生情况.结果发现：在不同基本培养基中愈伤组织发生时间和生长状况不同.茖葱鳞片在MS培养基中培养1周后大部分形成愈伤组织，且愈伤组织发生率最高(97.33%)；在WPM培养基中需要11 d形成愈伤组织，愈伤组织诱导率为81.67%；在White培养基中形成愈伤组织的时间为12 d，诱导率为75.67%.茖葱鳞片在MS培养基中形成的愈伤组织为乳白色、有光泽，生物量最大；在WPM和White培养基中形成的愈伤组织为浅褐色，颜色暗、生物量较小(表2、图1)，说明MS培养基提供的营养物质最接近茖葱生长需要，是最适宜茖葱组织培养的基本培养基.

表2 基本培养基与茖葱愈伤组织Tab.2 Basic medium and callus of Allium victorialis

图1基本培养基与愈伤组织Fig.1Basic medium and callus

2.3 愈伤组织诱导

2.3.1 6-BA、2，4-D组合与茖葱愈伤组织诱导效果

6-BA和2，4-D不同用量组合对茖葱愈伤组织诱导的效果不同.随着植物生长调节剂用量的增加，愈伤组织诱导率提高，生物量也增大.当6-BA用量为1.5 mg/L，2，4-D用量为0.2、0.3、0.4 mg/L时外植体启动较快(时间分别为7、6和7 d)，愈伤组织诱导率(分别为97.34%、98.56%、96.45%)和生物量(分别为2.17、2.46、2.31 g/瓶)高于其他组合(表3)，MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L诱导茖葱鳞片愈伤组织效果较好.

表3 6-BA和 2，4-D组合与愈伤组织诱导效果Tab.3 Effect of combination of 6-BA and 2，4-D on callus induction

2.3.2 6-BA、NAA组合与茖葱愈伤组织诱导效果

外植体接种3 d后开始膨大，10 d后陆续在外植体切口处出现愈伤组织.茖葱鳞片在6-BA 与NAA组合的MS培养基中愈伤组织形成时间晚于6-BA与2，4-D组合，鲜重也偏低.当培养基中的植物生长调节剂用量增加时，茖葱鳞片愈伤组织诱导率提高、生物量增大.在MS培养基中添加6-BA 1.5 mg/L，NAA为0.2、0.3和0.5 mg/L时愈伤组织发生早(时间分别为8、9、9 d)，诱导率(分别为98.75%、97.68%、94.54%)和生物量(分别为2.26、1.92、2.18 g/瓶)高于其他组合(表4)，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L诱导茖葱鳞片愈伤组织效果较好.

表4 6-BA 和NAA组合与愈伤组织诱导效果Tab.4 Effect of combination of 6-BA and NAA on callus induction

2.4 不定芽增殖

在超净工作台上将愈伤组织切成小块，转入不定芽诱导培养基中，培养3周时，愈伤组织开始出现小凸起，4周后愈伤组织陆续形成不定芽.不定芽分化率和数量随着MS培养基中6-BA用量的增加表现出先升高后下降的趋势，即当培养基中6-BA用量从0.5 mg/L提高到1.5 mg/L时，不定芽发生率和数量都呈上升趋势；当MS培养基中6-BA用量达到1.5 mg/L时，不定芽增殖效果最好；当培养基中6-BA用量为2.0 mg/L时，不定芽诱导率和数量不再增加(图2，表5).MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基中不定芽诱导率最高，达到97.66%，不定芽数量最多(平均5.16个).根据不定芽增殖效果，确定茖葱继代增殖培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，继代周期为45 d.

图2愈伤组织再分化Fig.2Redifferentiation of callus

表5 6-BA和NAA组合与不定芽诱导效果Tab.5 Effect of adventitious bud induction and combination of 6-BA and NAA

2.5 不定根诱导与移栽

将增殖培养中细弱的丛生不定芽切割下来转接到壮苗培养基(不添加生长调节剂的MS培养基)中培养.壮苗培养21 d后，将健壮芽苗转移到生根培养基中诱导不定根.茖葱不定芽在生根培养基中培养21 d后陆续生根.在1/2MS培养基中加入少量NAA即可生根，随着培养基中NAA添加量的增加，不定根诱导率和不定根数量都呈现先升后降的趋势.茖葱芽苗在1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L中不定根发生率最高(平均99.12%)、单株根数最多(平均5.12条)，培养30 d后根长1 cm以上(表6).不定根发生数量多的瓶苗叶片翠绿、生长较快(图2).

表6 6-BA和NAA组合与不定根诱导效果Tab.6 Effect of adventitious root induction and combination of 6-BA and NAA

茖葱组培苗根长至2.0 cm时，从培养瓶中取出，在含有1.2 g/L多菌灵的水溶液中洗去残留培养基，移栽到经过高锰酸钾灭菌的松针土、旱田土和草甸土中.第1周空气相对湿度保持在90%以上，第2周空气相对湿度保持在75%～80%，第3周空气相对湿度保持在70%以上.温度控制在20～25 ℃，前2周利用遮阴网降低光照强度，3周后转为自然光照.炼苗期间保持通风良好.组培苗移栽后每隔7 d喷1次1.2 g/L多菌灵水溶液.移栽3周后，组培苗长出新叶、发出新根，表明移栽成活，可以在自然条件下正常管理.

表7 不同基质与移栽成活率

不同基质与移栽成活率见表7.由表7可见：在3种移栽基质中，以松针土为基质时组培苗成活率最高(平均96.58%)，其次是草甸土(91.46%)，旱田土中组培苗成活率最低(86.87%).因此，建议在量化生产时选择松针土为茖葱组培苗移栽基质.

3 小结与讨论

3.1 小 结

优质苗木数量不足是当前茖葱规模化栽培的制约因素.针对这一问题，本文研究了茖葱愈伤组织诱导和再分化的培养基组成.结果发现：以茖葱鳞片为外植体时，采用0.1%氯化汞水溶液浸泡9 min是适宜的表面灭菌时间；茖葱鳞片在MS培养基中诱导的愈伤组织较好，以MS为基本培养基有利于茖葱组织培养；茖葱鳞片在MS培养基中加入6-BA与2，4-D或NAA组合都可以诱导愈伤组织，其中，MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L和MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L诱导愈伤组织效果较好；6-BA与2，4-D或NAA组合诱导的愈伤组织都能够分化出不定芽，而6-BA与NAA组合诱导的不定芽数量较多，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基不定芽诱导率最高，达到97.66%；茖葱芽苗在1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L中不定根发生率最高(平均99.12%)、单株根数最多(平均5.12条)，以松针土为基质时组培苗成活率最高(平均96.58%).

3.2 讨 论

优良的愈伤组织通常具有旺盛的自我增殖能力、高度的胚性或再分化能力，经过长期继代保存而不丧失胚性[19].能否诱导出优良的愈伤组织，不仅与培养基种类有关，而且与植物激素或植物生长调节物质种类及配比密切相关[20].刘济明等[21]研究表明，MS 培养基适合米槁叶片愈伤组织诱导，这与本次研究结果一致.在茖葱愈伤组织诱导过程中，MS培养基好于White和WPM培养基，愈伤组织发生时间短、颜色浅、生长快.不同质量浓度2，4-D和6-BA均对米槁叶片愈伤组织诱导有显著影响，而NAA不同质量浓度无显著影响[21]，但本次研究表明，6-BA分别与2，4-D、NAA组合均可以获得茖葱愈伤组织，说明不同植物对生长调节物质的反应不同.

外植体类型对愈伤组织的诱导效果起决定性作用，在以杉木叶片、茎段、子叶、下胚轴为外植体在MS培养基上进行愈伤组织诱导时，形成愈伤组织的能力为叶片>茎段>子叶>下胚轴[22]；以油茶花药为外植体可有效诱导愈伤组织形成[23]；以樟树未成熟的合子胚和叶片为外植体诱导愈伤组织效果较好[24].本次试验只选择了茖葱鳞茎为外植体，以其他材料诱导愈伤组织和再分化的情况也尚不清楚，还有待进一步开展研究.