过表达PRDM14非小细胞肺癌肿瘤细胞株的构建

卢亚楠，刘思珑，麻雨晴，刘梦琪，齐 悦

(北京城市学院生物医药学部，北京 100094)

引言

伴随着全球老龄化加剧，世界范围内患癌患者的人数不断上升，中国作为人口大国，无论是患癌患者还是因癌症死亡的人数都不容小觑。在世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据中显示，2020年全球癌症死亡病例996万例，其中中国新发癌症457万人，将近占全球的24%，而肺癌死亡人数就高达180万例，远超其他癌症类型，位居因癌症死亡人数第一。

根据病理组织不同，肺癌具体分为非小细胞癌和小细胞癌两种。非小细胞肺癌约占所有肺癌的85%，主要分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌三个亚型。与小细胞癌相比，非小细胞肺癌癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，因此约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率不足30%，手术治疗效果不理想，只能进行以化疗为主的综合性治疗。

PRDM14(正性调节区锌指蛋白14)作为转录调节因子，是PRDM家族成员之一，与细胞的增殖调控、分化、发育等密切相关，癌症以及一些其他疾病也与该因子异常有关。PRDM14在N端有1个PR结构域，在C端有6个锌指结构，含有的SET蛋白结构域已经检测到组蛋白甲基转移酶活性，可以对靶基因的染色质结构进行直接修饰，以此来实现基因的表达调控 。

刘冰冰等研究发现随着肺癌细胞分化程度的升高，PRDM14的表达水平也升高，推测PRDM14在肺癌发生的早期起作用，促进细胞增殖，在肺癌发展到严重分化不良时，可能由于PR域的CpG岛甲基化使mRNA表达受到抑制，引起了其蛋白表达的下调。另利用Western blot技术检测了PRDM14蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况，结果显示PRDM14蛋白的表达在肺鳞癌和腺癌中均高于癌旁正常组织，而且与非小细胞癌的分化程度有关，这提示我们PRDM14在非小细胞肺癌早期起着重要的作用。

Zhang等分析了手术切除后非小细胞肺癌病人PRDM14的表达水平与其预后的相关性。结果显示PRDM14在35.65 %的原发肿瘤样本中表达增加，在39.68 %的伴有淋巴转移的样本中表达增加，PRDM14表达的增加与肿瘤细胞的分化程度显著相关(p= 0.008)。因此，PRDM14可能成为非小细胞肺癌不良预后的潜在生物标志物。

近年来精准医疗的快速发展，基因靶向治疗是近年来新兴的治疗手段，具有特异性识别肿瘤细胞并杀死肿瘤细胞，对其他细胞危害较少等优点。靶向治疗为非小细胞癌提供了新的治疗手段，PRDM14基因有望成为非小细胞肺癌早期诊断和预后评估的新靶点。

本研究通过克隆人PRDM14基因，构建真核过表达载体后转染人的非小细胞肺癌细胞，得到高表达PRDM14的非小细胞肺癌细胞株，该细胞株不仅可以为后续非小细胞肺癌发生、发展以及耐药性等相关研究提供实验材料，还可以为后续靶向治疗非小细胞肺癌的方法探寻奠定理论基础。

一、实验材料

(一)实验耗材

NCI-H1975肺腺癌细胞系为中药与生物技术实验教学中心细胞房冻存；无水乙醇、异丙醇、1×TBE缓冲液、6×Loading Buffer、氨苄抗生素、LB培养基、DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜、1×TBST、脱脂奶粉、pcDNA3.1质粒和大肠杆菌DH5α感受态细胞等均购自北京爱科嘉生物科技有限公司。其余实验耗材见表1所列。

表1 实验耗材及品牌

(二)主要仪器

实验使用的主要仪器见表2。

表2 主要仪器及型号

二、实验方法

(一)PRDM14引物设计和基因扩增

在NCBI上获取人的PRDM14 cDNA序列(基因序列号：NM_024504.4)，采用Primer Premier 5.0设计上游引物F：5’-TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCTCTACCCCG-3’和下游引物R：5’-ACGGGCCCTCTAGEACTAGTAGTCTTCATGAAACTTCATGTGG-3’，引物中含有载体同源臂序列。以人的胚胎干细胞cDNA为模板，通过PCR扩增得到PRDM14。

PCR扩增条件：95℃预变性10 min，94℃变性15 s，56℃退火5 s，72℃延伸90 s，循环30次，72℃终延伸5 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物条带，参照Magen凝胶DNA小量回收试剂盒的方法进行回收纯化。

(二)重组载体的构建

用EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3.1载体质粒，用胶回收试剂盒回收质粒并实行纯化。利用诺维赞同源重组试剂盒，建立目的片段PRDM14与pcDNA3.1载体的无缝克隆连接体系，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，置于氨苄抗性平板上，37℃培养箱培养过夜，次日挑选单克隆菌落，摇菌后进行菌液PCR检测，选择经电泳验证条带正确的菌液送生物公司测序。参照Magen去内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取。

(三)质粒转染

取对数生长期的NCI-H1975细胞接种于6孔板中，待细胞密度达70%-80%时准备转染，转染前换液。取一个洁净无菌离心管，向待转染的六孔板中每孔的NCI-H1975细胞加入125 μL不含抗生素和血清的DMEM培养液，加入2.5 μL质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4 μL Lipo8000TM转染试剂，用枪轻轻吹打混匀后加入6孔板中，培养48 h。设立空白对照组、pcDNA3.1空载体对照组及pcDNA3.1-prdm14过表达组。

(四)Western blot

用蛋白裂解液提取细胞蛋白质，100℃水浴10 min，使其变性后进行SDS-PAGE检测，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用一抗稀释液以1∶4000比例稀释GAPDH Mouse Monoclonal Antibody和Anti-PRDM14，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5 min；再加以1∶4000比例稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗，室温轻摇1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；采用化学发光法显色，将发光液A和B按等体积混合，均匀滴加在PVDF膜上，孵育1 min，在显影仪中进行显影并拍照。

三、实验结果

(一)PCR扩增PRDM14基因电泳结果

人的PRDM14 CDS全长为1716 bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，条带大小与预期大小一致，可以进行胶回收纯化，得到目的基因片段。

图1 PCR扩增得到PRDM14目的基因

(二)pcDNA3.1质粒双酶切电泳结果

pcDNA3.1质粒图谱如图2所示，通过建立酶切反应体系进行双酶切，获得线性化载体片段，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，双酶切产物条带位置与原始质粒线性条带位置一致，说明酶切完全，可以进行胶回收，得到高浓度的线性化载体片段。

图2 pcDNA3.1质粒图谱

图3 载体双酶切电泳鉴定

(三)过表达PRDM14真核表达载体的构建

通过酶切连接的方式将PRDM14片段重组到pcDNA3.1载体的多克隆位点，构建成pcDNA3.1-prdm14的重组载体。经过大肠杆菌扩增和菌液PCR鉴定，PCR鉴定时选择载体上的T7位点设计上游引物，在插入目的基因片段上设计下游引物，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图4所示，在217 bp处有单一条带的即为阳性克隆，阳性克隆菌测序鉴定正确。提取重组质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图5所示，条带位置在7100 bp左右，与预期一致，测定其浓度为596 ng/μL。

图4 菌液PCR鉴定阳性克隆

图5 重组质粒电泳结果

(四)Western Blot检测PRDM14蛋白的表达

复苏培养人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975，待细胞生长至汇合度达70%，以合适密度接种至细胞培养板。利用去内毒素质粒大提试剂盒回收重组质粒pcDNA3.1-prdm14，采用脂质体转染重组质粒至细胞，72 h后收集细胞并提取蛋白质。经过Western Blot检测分析，目的蛋白PRDM14在NCI-H1975细胞中可以正常表达(如图6所示)。

图6 Western Blot 检测PRDM14蛋白的表达

结语

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率长居前列，同时，还有着早期诊断率低、化疗副作用大、五年生存率较低等问题。近年来，探索非小细胞肺癌的靶向治疗方式主要有两个方向：一个是为没有特异性药物的已知驱动基因寻找到有效的靶向药物，另一个是寻找新的驱动基因。越来越多的非小细胞肺癌晚期病人接受了靶向药物的治疗，明显延长了无进展生存期和总生存期，提高了生活质量。目前，已有研究表明PRDM14与非小细胞肺癌的发生发展有着密不可分的联系，进一步探究PRDM14对非小细胞肺癌细胞增殖过程的影响，有望为寻找新的治疗靶点提供理论依据。

本研究以人胚胎干细胞cDNA为模板，PCR扩增PRDM14基因片段，将其连接至pcDNA3.1载体并转染至非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中，成功构建了过表达PRDM14的非小细胞肺癌细胞株，为后续深入研究该基因的功能提供了重要的实验材料。