水苏糖对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用

王雨欣，黄雨彤，杨盼盼，姜松松

（扬州大学旅游烹饪学院 江苏扬州 225127）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种炎症性肠病。流行病学调查显示，美国和西欧等国家UC 的发病率较高[1]，亚洲地区UC 的患病率较低，然而，值得注意的是，实际患病人群可能远高于目前统计数据，且近年来UC 发病率显著提高[2-3]。UC 的临床症状主要为腹泻、黏液便秘、脓血等临床表现[4]，严重危害了人们的健康。该病多发于青壮年群体，难以痊愈、反复发作，发生癌变可能性大，一直以来被世界卫生组织列为疑难病[5]。

由于UC 的发生受多种因素影响，其具体病因和发病机制尚未完全明确。目前的治疗药物主要有5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素等[6]。5-氨基水杨酸类药物具有一定的治疗效果，然而，其特殊药代动力学机制使其对结肠外的病变几乎无疗效；糖皮质激素可在短时间内缓解重度患者的急性症状，而长期使用会出现骨质疏松，甚至股骨头坏死等并发症[7]。寻找治疗UC 的有效成分是研究重点。

近年来，众多研究学者发现许多天然植物活性成分具有潜在治疗UC 的作用。如乳香的有效成分五环三萜烯酸可非竞争性抑制脂氧合酶，抑制白三烯的合成，发挥治疗作用；姜黄素可以通过抑制一氧化氮、白三烯等因子的表达而发挥抗炎作用[8]。水苏糖是一种天然性低聚糖，其甜味弱，能量低，可以代替蔗糖。水苏糖主要是从草石蚕中提取，目前有方法制得的水苏糖纯度高达99%[9]。有研究表明，水苏糖能显著提高小鼠肝匀浆SOD 水平，对环磷酰胺所致肝损伤起到保护作用[10]，且可以通过减少肠道内氨的吸收而对临床/亚临床肝性脑病（HE/SHE）起到一定的预防作用[11]。水苏糖已被证实可以调节肠道菌群，改善便秘等症状，然而，对肠道疾病的改善作用方面，目前国内外还鲜有报道。

本研究以水苏糖为研究对象，利用葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS）诱导建立溃疡性结肠炎小鼠模型，给予水苏糖干预处理，通过相关指标的测定，明确其干预作用，并初步探究其作用机制，以期为开发抗结肠炎的药物或功能性食品提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

苏舒牌水苏糖，北京顺天广泽科贸有限公司；葡聚糖硫酸钠（DSS），美国MP Biomedicals 公司；MPO 试剂盒、IL-1β 试剂盒、IL-6 试剂盒、TNF-α试剂盒，美国BD 公司；BCA 蛋白定量试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 实验动物

4 周龄SPF 级雌性ICR 小鼠50 只，体质量17～24 g，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SYXK（苏）2017-0044。小鼠5 只1 笼饲养，适应性喂养1 周。试验期间小鼠自由摄食、饮水。试验期为4 周，每3 d 测1 次体质量，给药方式为灌胃。每日记录，观察小鼠体质量、稀便、血便的情况。实验于特定病原体（SPF）级动物房中进行。

1.3 动物分组与模型建立

将小鼠随机分为5 组，包括生理盐水组、DSS模型组、水苏糖低剂量组[0.25 g/（kg·d）]、中剂量组[0.5 g/（kg·d）]、高剂量组[1.5 g/（kg·d）]，每组10只。第1～7 天生理盐水组与DSS 模型组每日一次性灌胃0.2 mL 生理盐水，水苏糖低、中、高剂量组每日一次性灌胃0.2 mL 不同浓度的水苏糖溶液，各组均处理7 d。第8 天起，DSS 模型组、水苏糖各剂量组每日一次性灌胃0.2 mL 4 g/kg DSS 溶液，水苏糖持续给药，生理盐水组灌胃等量生理盐水。实验期间观察小鼠大便形状和隐血情况，每3 d称量1 次体质量。第14 天进行小鼠眼眶采血，离心后取血清用于ELISA 法测定炎症相关因子的表达。小鼠采血后统一处死，取结肠组织，评估小鼠结肠损伤程度，其余结肠组织用于测定髓过氧化物酶含量和Western blot 实验。本实验符合动物伦理学相关规定。

1.4 评价指标

1.4.1 疾病活动指数 （Disease activity index，DAI）评估 每日观察小鼠体质量、大便性状和隐血情况，按表1进行评分[12-14]。根据公式“疾病活动指数=（体质量评分+大便性状评分+隐血评分）/3”计算每只小鼠的DAI，评估疾病活动情况。

表1 疾病活动指数评分标准Table 1 Disease activity index scoring criteria

1.4.2 结肠组织长度测定 小鼠处死后，取盲肠末端和近端直肠之间的结肠，测量结肠长度[15]。

1.4.3 结肠大体形态评分和组织病理学评分 小鼠处死后，取小鼠2 cm 病变严重结肠浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定组织，石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡后染色，用于结肠大体形态[16]和组织病理学评分[17]，评分标准见表2。

表2 结肠大体形态和组织病理学评分标准Table 2 Colonic morphological and histopathological scoring criteria

1.4.4 髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）含量的测定 小鼠处死后，取小鼠远端结肠段约3 cm，加入适量生理盐水进行匀浆，匀浆液以3 000r/min，4 ℃，离心10 min，取上清液进行MPO 含量的测定。具体检测步骤参照MPO ELISA 试剂盒说明书。

1.4.5 ELISA 法测定IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表达水平 干预结束后小鼠内眦静脉采血，以4 500 r/min，4 ℃，离心10 min，取上清，-80 ℃保存，待测。具体检测步骤参照ELISA 试剂盒说明书。

1.4.6 蛋白质印迹分析 （Western blot） 取结肠组织，采用RIPA 裂解液进行蛋白提取，并通过BCA 法测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE 后，转移到PVDF 膜上，将膜置于5% BSA-TBST 中，水平摇床孵育1 h 封闭。然后与NF-κB p65（1∶1 000）4 ℃水平摇床孵育过夜。膜用TBST 洗涤3 次，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000） 室温孵育40 min，TBST 洗膜3 次。通过ECL 法显色，用Image J 软件分析目的蛋白与内参蛋白β-actin 的灰度值比值，计算其相对表达量。

1.5 统计学处理方法

2 结果与分析

2.1 一般状态观察

有研究表明UC 会导致患者的体重减轻[18]。因此，本研究首先观察了各组小鼠体质量变化，结果如图1所示，前7 d 各组小鼠体质量稳定上升，精神状态良好，活动能力正常；自第8 天灌胃DSS 溶液开始，除生理盐水组，各组小鼠体质量持续下降，小鼠出现精神呆滞，活动能力下降，饮食、饮水量下降，大便稀溏的现象。水苏糖各剂量组于第13 天起体质量开始增加，小鼠精神状态有所好转，活动能力有所上升，饮食饮水量增加，大便逐渐正常；模型组小鼠出现便血现象，精神萎靡、易惊恐，体质量持续下降。

图1 各组小鼠体质量变化情况Fig.1 Body mass changes of mice in different groups

2.2 疾病活动指数（DAI）评分结果

UC 小鼠的症状表现与人类UC 相似，会导致腹泻、便血等症状[19]。因此，本研究评估了小鼠的疾病活动指数，结果如图2所示，生理盐水组小鼠疾病活动指数基本正常，模型组小鼠造模后出现稀便、便血等症状，其疾病活动指数显著高于生理盐水组（P＜0.001），水苏糖各剂量组小鼠疾病活动指数显著低于模型组（P＜0.001），稀便、便血等症状均得到一定程度缓解。

图2 各组小鼠疾病活动指数评分Fig.2 Disease activity index of mice in different groups

2.3 结肠长度测量结果

溃疡性结肠炎会引起结肠充血水肿，进而出现结肠缩短现象[20]。因此，本研究测量了小鼠结肠长度，结果如图3所示，与生理盐水组相比，模型组小鼠结肠显著缩短（P＜0.001）。与模型组相比，低剂量水苏糖虽在一定程度上可以缓解结肠缩短现象，而小鼠结肠长度无显著性差异（P ＞0.05），中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图3 各组小鼠结肠长度Fig.3 Length of colon of mice in different groups

2.4 大体形态和组织病理学评分结果

UC 经典组织学变化包括隐窝密度降低，隐窝结构变形和严重的弥漫性黏膜炎症等[21]。因此，本研究进行了小鼠结肠大体形态与组织病理学评分，结果如图4所示，生理盐水组小鼠结肠大体正常，模型组小鼠可见结肠黏膜充血、水肿，固有层炎性细胞大量浸润等。水苏糖各剂量组小鼠结肠较模型组有明显好转，部分黏膜及黏膜下层仍有少量炎性细胞浸润。模型组大体评分、组织病理学评分显著高于生理盐水组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，水苏糖各剂量组均能降低UC 小鼠大体形态和组织病理学评分，而低剂量组均无显著差异（P＞0.05），中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 各组小鼠结肠大体形态和组织病理学评分Fig.4 Colonic morphological scores and histopathological scores of mice in different groups

2.5 MPO 含量的检测结果

MPO 是炎症反应的关键酶[22]，炎症发生会引起MPO 含量的增加。因此，本研究检测了小鼠结肠组织MPO 含量，结果如图5所示，模型组小鼠结肠MPO 含量显著高于生理盐水组，差异具有统计学意义（P ＜0.001）。与模型组相比，水苏糖低、中、高剂量组均能显著降低UC 小鼠结肠MPO 含量（P ＜0.001）。

图5 各组小鼠结肠MPO 含量Fig.5 Colonic myeloperoxidase content of mice in different groups

2.6 结肠炎症细胞因子含量检测结果

当炎症性肠病发生时，结肠组织中会出现大量炎细胞浸润[23]，使促炎因子表达升高，如IL-1β、IL-6、TNF-α 会大量释放[24]。因此本研究检测了小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的分泌水平，结果如图6所示，与生理盐水组相比，模型组小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平均显著增加（P＜0.001）。给予水苏糖干预后，低、中、高剂量组小鼠血清中IL-1β 表达水平较模型组显著降低（P＜0.001），而中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；水苏糖各剂量组均能降低小鼠血清中IL-6 和TNF-α 的分泌水平，而低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.001）。

图6 各组小鼠血清细胞因子含量Fig.6 Serum cytokines content of mice in different groups

2.7 水苏糖对NF-κB 信号通路的影响

NF-κB 信号通路参与调控炎症反应，关键蛋白分子NF-κB p65 在UC 患者结肠中高度表达[25]，此外有研究发现，在溃疡性结肠炎患者肠道黏膜巨噬细胞及上皮细胞中NF-κB 信号途径被激活[26]。因此推测水苏糖可能通过抑制NF-κB 信号途径从而发挥改善结肠炎的作用，本研究取结肠组织，进行Western blot 实验，检测结肠组织中NF-κB p65 的表达水平，结果如图7所示。模型组小鼠结肠组织中NF-κB p65 的蛋白表达较生理盐水组显著增加（P＜0.001）。与模型组相比，水苏糖低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.001）。

图7 Western blot 检测小鼠结肠组织NF-κB p65 的蛋白表达Fig.7 Western blot detection of NF-κB p65 protein expression in mice colonic tissues

3 讨论

溃疡性结肠炎属于炎症性肠病，人群发病率呈上升趋势。临床治疗多以控制炎症、抑制自身免疫反应等措施为主[27]。DSS 诱导的溃疡性结肠炎模型与人类UC 相似，是研究结肠炎的一种常用模型，目前大多以蒸馏水配制DSS 溶液给予动物自由饮用造模，有研究对比了DSS 自由饮用与灌胃诱导UC 小鼠，结果显示灌胃法诱导的UC 小鼠模型动物表现更均一且成本低[28]，因此本实验采用4 g/（kg·d） DSS 溶液给ICR 雌性小鼠灌胃7 d诱导的UC 小鼠模型，结果显示，模型组小鼠体重下降明显，存在腹泻、便血现象，大量炎性细胞浸润，炎症状态较明显。

本研究中生理盐水组和水苏糖各剂量组的DAI 评分显著低于模型组，且从结肠大体形状和病理学评分来看，水苏糖中、高剂量组对UC 小鼠具有一定改善作用，可见水苏糖能在一定程度上减轻溃疡性结肠炎对结肠造成的损伤与炎症反应。该结果表明，水苏糖可以改善DSS 诱导的UC小鼠的结肠黏膜炎症表现，对促进组织修复、抑制炎症反应方面有一定的作用。

氧化应激是导致UC 发病的重要因素之一[29]，MPO 是反映氧化应激的重要指标。作为血红素过氧化物酶超家族成员之一，MPO 主要存在于中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞中，MPO 的升高可间接反应炎性细胞数量的增多[30]。UC 患者肠道中MPO 含量明显增加，可作为是否患UC 的判断依据[31]。本研究中模型组MPO 含量明显高于生理盐水组，说明使用DSS 成功诱导UC 小鼠模型。与模型组相比，水苏糖各剂量组均能显著降低结肠MPO 含量，表明水苏糖能降低小鼠结肠中过氧化氢氧化的能力，可以减轻炎性细胞聚集，一定程度上抑制氧化应激反应，减轻结肠组织内的炎症反应。

NF-κB 作为在机体内广泛存在的重要转录因子，其介导的信号途径参与机体炎症反应的调节[32]。NF-κB 信号途径在UC 中起到重要作用[33]，冯小娟等[34]研究表明，Mes 对UC 的治疗效果可能与PXR/NF-κB 信号通路有关。NF-κB 主要以二聚体形式存在于真核生物结肠上皮细胞中，以p65 发挥主要转录激活作用[35]。细胞因子在炎症反应中起重要作用，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等[36]。IL-1β由单核巨噬细胞分泌，能激活致病性T 细胞参与机体炎症反应[37]；IL-6 作为一种多效性细胞因子在IBD 慢性炎症反应中起关键作用[38]；TNF-α 可以激活NF-κB 信号通路进一步加重炎症反应[39]。当炎症刺激时，NF-κB 可上调IL-1β、IL-6、TNFα mRNA 表达，导致IL-1β、IL-6、TNF-α 释放增加[40]，当这些炎症因子释放后，可正反馈调节NFκB 的表达，使炎症不断加重[41]。本文研究结果显示，DSS 诱导的UC 模型小鼠结肠组织NF-κB p65 蛋白表达明显上调，提示UC 发生与NF-κB表达密切相关；水苏糖干预后，中、高剂量组小鼠结肠组织NF-κB p65 蛋白表达明显下降，表明NF-κB 信号通路可能是水苏糖改善UC 的重要作用机制之一；水苏糖各剂量组均能显著降低IL-1β、TNF-α 表达水平，然而低剂量组对IL-6 表达水平无显著影响，表明水苏糖在达到一定浓度后能调节肠道炎症因子分泌并降低表达水平，由此推测水苏糖对UC 的改善作用可能是通过减少结肠中单核巨噬细胞数来实现的；中、高剂量组无显著差异，提示水苏糖的改善作用可能有限制范围，仍待进一步深入分析。

综上所述，水苏糖对小鼠溃疡性结肠炎具有一定改善作用，可明显改善UC 小鼠的一般情况和结肠组织损伤，降低MPO 含量，减少炎症因子释放，可能抑制NF-κB 信号通路的过度激活。同时，水苏糖各剂量间相比，中、高剂量组对UC 小鼠的改善效果显著优于低剂量组，说明水苏糖溶液浓度和治疗效果具有一定相关性，然而中、高剂量组间差异不明显，故仍需后续探索研究。本研究为以水苏糖为原料，开发治疗溃疡性结肠炎或相关功能食品提供依据。