EZH2抑制剂(GSK-126)对小鼠肝纤维化的保护作用

刘志丹，王金丽，金胜洁，王俏铃，韩娇娇，金倩仪，阮群超，郑永霞

(嘉兴学院 医学院，浙江嘉兴314001)

肝纤维化是所有慢性肝脏疾病形成的共同病理反应过程，它是肝脏损伤与修复反应失衡的结果，可导致肝硬化.它的特征是肝组织内细胞外基质成分过度增生与沉积.临床认为：在适当手段干预下，肝纤维化是可以逆转的，但患者一旦发展到肝硬化阶段，则很难治愈.肝纤维化的中心环节是肝星状细胞的活化，[1]肝星状细胞活化后获得了成纤维细胞的表型，使其由储存维生素A的储脂细胞转化为肌成纤维细胞，它具有强大的增殖、收缩和纤维化发生的能力.

果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)是一种组蛋白甲基转移酶，使组蛋白H3的第27位赖氨酸发生三甲基化修饰 (H3K27me3)，[2]H3K27me3是一类重要的转录抑制性标记.近年来研究发现：EZH2具有调节肌成纤维细胞的转化并参与多个组织的纤维化，包括肾纤维化、肺纤维化等，[3]目前EZH2与肝纤维化的关系也逐渐得到证实.研究显示，EZH2可通过提高Wnt通路的活性促进肝星状细胞的活化和肝纤维化.[4-5]EZH2抑制剂(下文简称GSK-126)作为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的竞争性抑制剂，对EZH2的选择性比其他20种人甲基转移酶高1000多倍，[6]且GSK-126在2014年已进入I期临床试验，用于治疗晚期实体瘤或者B细胞淋巴瘤.[7-9]尽管已有研究显示：GSK-126可调节肝细胞的可塑性和改善肝衰竭小鼠的疾病严重程度，然而在肝纤维化方面的研究尚未见诸报道.

为了探讨GSK-126在肝纤维化保护中的作用，本文利用不同剂量(5mg/kg和15mg/kg)的GSK-126(EZH2的抑制剂)处理CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，并从病理染色、肝功能等方面来观察GSK-126对肝纤维化保护的作用.

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级Balb/c小鼠(24只)，由嘉兴学院动物实验中心培育，体重21±3.5 g，雌雄各半；GSK-126(上海陶素生化科技有限公司)、CCl4(上海联试化工试剂有限公司)、花生油(益海粮油工业有限公司)、苏木精及伊红(南昌雨露实验器材有限公司)、天狼猩红染液(北京雷根生物技术有限公司)、酶标仪(上海沛欧分析仪器有限公司)、小鼠ALT酶联免疫分析试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)、Masson染色试剂盒(北京索莱宝生物有限公司)、天狼猩红染色试剂盒(北京索莱宝生物有限公司).

1.2 CCl4诱导小鼠肝纤维化

将小鼠分为4组，每组6只，实验周期为20天.

1)正常对照组：按5mL/kg的剂量皮下注射食用油，每3天1次，共注射6次；

2)肝纤维化组：按5 mL/kg的剂量皮下注射体积分数为20% 的CCl4油剂溶液(CCl4∶橄榄油=1∶4)，每3天1次，共注射6次；

3)CCl4+ GSK-126 5mg/kg组：按5 mL/kg的剂量皮下注射体积分数为20% CCl4的油剂溶液(CCl4∶橄榄油=1∶4)的同时，按5mg/kg的剂量皮下注射GSK-126，每3天1次，共注射6次；

4)CCl4+GSK-126 15 mg/kg组：按5mL/kg的剂量皮下注射体积分数为20% CCl4的油剂溶液(CCl4∶橄榄油=1∶4)的同时，按15 mg/kg的剂量皮下注射GSK-126，每3天1次，共注射6次.

20天培养周期结束后，腹腔注射5%水合氯醛溶液麻醉，心脏取血，解剖取出小鼠的肝脏，称重并记录.同时观察小鼠肝脏的大体形态，将取出的肝脏组织放置在甲醛溶液中固定，用于制作石蜡包埋块，血清则于冰箱内保存备血清指标检测.

1.3 血清谷丙转氨酶(ALT)的测定

用1.5 mL 5%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，小鼠麻醉后，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取0.5～0.6 mL血液，置于含有肝素的试管中，静置30 min，离心，取上清.谷丙转氨酶的测定按照小鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)ELISA试剂盒说明书进行操作：在包被板上进行标准品孔、空白孔以及待测样品孔的设置与加样；然后用封板膜封板后置37 ℃温育30 min；洗涤，加酶，置37 ℃温育30 min，洗涤；加显色剂后避光显色15 min后，终止反应.以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(测定应在加终止液后15 min以内进行).计算：以标准物的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，做标准曲线，计算其直线回归方程式，然后根据样品值用标准曲线方程算出浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度.

1.4 组织病理分析

对肝脏组织切片进行HE染色、Masson染色、天狼猩红染色并在光镜下观察.

1.4.1 HE染色

取新鲜肝脏组织块(厚度0.5 cm)投入10%福尔马林中固定12 h后，依次将其放入 60%乙醇(1 h)→70%乙醇(1h)→80%乙醇(1 h) →90%乙醇(45 min)→95%乙醇(30 min)→95%乙醇(15 min)→100%乙醇(15 min)→100%乙醇(15 min)→二甲苯溶液(15 min)→二甲苯溶液(15 min)→60 ℃石蜡I (1.5 h) →60 ℃石蜡II(2 h)；然后将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，并切成4μm厚的切片；再将切片依次放入二甲苯(I)25 min→二甲苯(Ⅱ)25 min→100%酒精 2 min→95%的酒精 2 min→80%酒精 2 min→75%酒精2 min→蒸馏水洗2 min，脱去切片中的石蜡；再放入苏木素染色5 min，自来水冲洗；盐酸酒精分色10 s；流水缓慢冲洗15 min后分别放入70%和90%酒精中各脱水10 min；伊红溶液染色2～3 min；用常规梯度酒精进行脱水后再用二甲苯透明，最后用中性树脂封片即可.

1.4.2 Masson染色

先将肝组织切片(4 μm)、脱腊；用Weigert铁苏木素染色8 min，酸性乙醇分化，蒸馏水洗；再用Masson丽春红酸性复红液染色5～10 min；以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸溶液分化3～5 min；不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染5 min.以0.2% 冰醋酸水溶液浸洗片刻；再用95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固.

1.4.3 天狼猩红染色

用10%的福尔马林固定肝脏组织,常规脱水包埋，切成6μm厚的切片；用二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,蒸馏水浸泡；weigert铁苏木素染色液染色10～20 min；用自来水洗5～10 min，蒸馏水洗1次；天狼猩红染色液滴染1 h，流水冲洗，去除切片表面的天狼猩红染色液，再常规脱水至透明，最后用中性树胶封固.

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 肝脏形态图

为了观察GSK-126对小鼠肝纤维化的影响，我们基于CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，[10]观察不同剂量的GSK-126对肝脏形态的影响.结果显示：正常对照组(图1A)小鼠肝脏体积正常，表面光滑质软，肝组织红润、呈红褐色，边缘锐利；肝纤维化模型组(图1B)小鼠肝脏体积明显增大，表面粗糙，失去光泽，有较多灰白色小结，质地变硬，边缘钝圆，表明其肝纤维化模型成功.GSK-126 5 mg/kg组(图1C)和15 mg/kg组(图1D)相比，小鼠肝脏体积有不同程度的缩小，色泽得到一定恢复、质地变软、边缘变薄，但仍存在病变现象，且GSK-126 15mg/kg组小鼠肝脏状态较好.该结果提示，GSK-126可能具有减轻肝纤维化的作用.

A.对照组

B.CCl4处理组

C.GSK-126 5mg/kg组

D.GSK-126 15mg/kg组

2.2 肝重指数

模型组与对照组相比较，采用t检验，差异有统计学意义(t=3.304,p=0.0298)，模型组的肝重指数(5.94±0.449)明显高于对照组(4.59±0.547)，说明CCl4诱导小鼠发生了肝纤维化.利用方差分析的方法对GSK-126 5 mg/kg组、GSK-126 15 mg/kg组以及模型组的肝重指数进行分析，结果显示：GSK-126 5 mg/kg组、GSK-126 15 mg/kg组的肝重指数与模型组的肝重指数存在显著差异(F=8.443,p=0.0073)，GSK-126低、高剂量组的肝重指数均低于模型组(p<0.05)，由此说明，GSK-126对肝纤维化的发生具有一定的抑制作用.

表1 肝重指数 (x±s)

2.3 谷丙转氨酶(ALT)测定结果

由表2可知，模型组小鼠的ALT活性显著升高，可见肝纤维化小鼠模型造模成功；利用方差分析的方法对GSK-126 5 mg/kg组、GSK-126 15 mg/kg组以及模型组的ALT活性进行分析，结果显示：GSK-126 5 mg/kg组、GSK-126 15 mg/kg组的ALT活性与模型组存在显著差异(F=8.443,p=0.0073).GSK-126 5 mg/kg组、GSK-126 15 mg/kg组的肝重指数均低于模型组(p<0.05)，由此说明，GSK-126对肝纤维化的发生具有一定的抑制作用.

表2 血清谷丙转氨酶的活性(x±s)

2.4 HE染色图

HE染色能较直观地发现小鼠肝脏细胞的损伤情况，进而判断GSK-126在肝纤维化进程中是否能够改善肝细胞损伤.[11-12]由HE染色图谱(图2)可见，对照组(图2A)小鼠肝细胞形态正常，排列整齐，较少出现肝细胞结构异常，无病变或坏死.模型组(图2B)小鼠肝脏局部灶性坏死，细胞核溶解，伴有脂肪变性及炎症细胞浸润现象.GSK-126 5 mg/kg组(图2C)小鼠肝细胞排列较为整齐，肝细胞结构异常少见，轻度肝细胞水肿，肝细胞病变或坏死症状少见.GSK-126 15 mg/kg组(图2D)小鼠肝细胞形态、排列接近对照组小鼠，无明显病变现象，仅存在轻度的水肿现象，说明GSK-126对肝纤维化有一定的保护作用.

A.对照组

B.CCl4处理组

C.GSK-126 5mg/kg组

D.GSK-126 15mg/kg组

2.5 Masson染色图

Masson染色可直接显示汇管区周边纤维增生情况，经Masson染色后所得的图片显示，对照组(图3A)小鼠的肝脏组织基本无纤维化现象；而模型组(图3B)小鼠的肝纤维化程度严重，血管与血管之间存在明显的交联；GSK-126 5 mg/kg组(图3C)小鼠的肝纤维化程度相对于模型组来说明显降低；GSK-126 15 mg/kg组(图3D)小鼠的纤维化程度较GSK-126 5 mg/kg组改善更加明显，说明GSK-126对改善小鼠肝纤维化确实有作用.

A.对照组

B.CCl4处理组

C.GSK-126 5mg/kg组

D.GSK-126 15mg/kg组

2.6 天狼猩红染色图

天狼猩红染色是将小鼠的肝脏组织中的胶原纤维染成红色，细胞核染成蓝色，由此判断小鼠的肝纤维化程度.[13]在各组小鼠的天狼猩红染色结果中我们发现，对照组(图4A)小鼠的肝脏中几乎无胶原纤维分布，仅静脉区域有少量的胶原纤维分布.模型组(图4B)小鼠的肝脏在静脉与静脉之间形成明显的胶原纤维，并且将肝脏平面分割开来，同时伴有严重的坏死症状.GSK-126 5 mg/kg组(图4C)、GSK-126 15 mg/kg(图4D)组能明显看见胶原纤维增生现象，但相对模型组来说，症状明显减轻，并且GSK-126 15 mg/kg组症状最轻，因此，GSK-126对肝纤维化具有较好的保护作用.

A.对照组

B.CCl4处理组

C.GSK-126 5mg/kg组

D.GSK-126 15mg/kg组

3 结语

本文就GSK-126对CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型是否具有保护作用进行了探究，通过病理学、HE染色、天狼猩红染色及Masson染色等分析肝脏形态变化。结果发现，模型组存在较严重的病变现象，表明其肝损模型建立成功.而GSK-126低、高剂量组小鼠在GSK-126干预下其病变结构较少见，各项指标均有不同程度的好转，GSK-126 15 mg/kg组保护效果更佳.该结果与DNZep抑制肝纤维化的结论是一致的，而DNZep以SD大鼠为模型，DNZep的药物浓度是2 mg/kg，本研究中GSK-126的浓度是5 mg/kg，且15 mg/kg的GSK-126有更好的保护效果.因此，DNZep和GSK-126的剂量还值得进一步研究.

本实验中GSK-126是预防性用药，在CCl4诱导肝纤维化过程中就同时给药GSK-126，而GSK-126作为治疗性用药治疗肝纤维化的研究仍需要探讨其剂量、给药方式以及联合用药的方案，由于GSK-126已用于治疗肿瘤的临床试验，因此具有一定的安全性.