外泌体microRNA 在心血管疾病中的研究进展及其法医学应用前景

马晓楠，路陆，黄琰潼，岑昌谦，苏枫元，施翌，曹志鹏

1.中国医科大学法医学院 辽宁省法医学生物证据重点实验室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学临床三系，辽宁 沈阳 110122；3.南通市海门区公安局，江苏 南通226100

外泌体是来源于多种细胞（如平滑肌细胞、内皮细胞、干细胞等）的纳米级双层膜囊泡，广泛存在于血液、尿液及唾液等体液中。外泌体内含有蛋白质、微小RNA（microRNA，miRNA）、DNA 等，其中miRNA 是一类长度为21～25 nt 且高度保守的非编码小RNA，由真核细胞自身产生，属于内源性非编码单链RNA，在器官形成、表观调控等方面起到重要作用。近年来，外泌体miRNA 在生物体生长发育、细胞增殖分化、疾病发生发展中的作用被大量研究，其在心血管疾病的预测、治疗、预后中的价值被广泛证实。

心脏性猝死是法医学鉴定工作中的重要内容，但在实际鉴定中，缺乏典型形态学改变的心脏性猝死成为法医学鉴定的难题之一。有研究[1]表明，心脏性猝死者心肌组织中一些miRNA 呈特异性表达。因此，本文就外泌体miRNA 的生物学特征及其与心血管疾病的关系以及在法医学中的应用前景进行综述，以期为临床心血管疾病的治疗及心脏性猝死的法医学鉴定提供参考。

1 外泌体miRNA 的生物学特征

1.1 外泌体miRNA 的形成

外泌体的形成经历一系列复杂的细胞内分泌过程，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，多囊泡体可与细胞膜融合形成外泌体释放到细胞外[2]。

miRNA 由相关基因在细胞核内经历转录、剪接、修饰等过程并经转运蛋白运送至细胞质，在胞质中与外泌体靶向结合成为外泌体miRNA，然而其具体机制尚不明确，可能与类泛素化的不均一核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNP A2/B1）有关，hnRNP A2/B1 可识别并结合不同miRNA 表面的特异性序列，控制其与外泌体的靶向结合[3]。

1.2 外泌体miRNA 的特性

在生理刺激或病理状态下，多种活性细胞可分泌直径为30～100 nm 的外泌体，内含蛋白质、miRNA、DNA 等[4]。外泌体miRNA 具有以下特性：（1）高度稳定性。外泌体具有双层脂膜结构，具有高度的生物学稳定性，可抵御低温冷藏和酶的降解[5]。（2）组织特异性。外泌体可来源于多种活性细胞，不同来源的外泌体因其表面标志物的不同具有组织特异性[6]，可通过分析miRNA 表达谱鉴定外泌体来源细胞。（3）细胞病理生理状态的指示性。由于外泌体miRNA 一般在细胞缺氧、坏死等特殊病理生理状态下产生，且外泌体内容物的成分与其分泌细胞的病理生理状态密切相关，因而具有诊断价值[7]。除此之外，纳米级的外泌体因其天然无毒、易获取且可穿过生物屏障等特性成为理想的药物和基因运载体。

1.3 外泌体miRNA 的效应机制

外泌体广泛存在于血液、尿液等体液中，可通过膜融合、信号介导或内吞作用等方式进入靶细胞，也可释放miRNA 等生物活性物质进入靶细胞。MONTECALVO 等[8]发现，外泌体通过内吞作用进入靶细胞后可释放内容物，实现分泌细胞与靶细胞的信息传递，进而诱导靶细胞生理状态发生相应改变。外泌体miRNA 进入靶细胞后，可与靶基因mRNA 的3′端非翻译区结合，诱导靶RNA 降解或抑制其翻译，从而调节靶细胞生理过程。

2 外泌体miRNA 与心血管疾病

2.1 外泌体miRNA 与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是引起脑梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病的主要原因，其过程与内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞的迁移及增生等有关。而外泌体miRNA 可以通过调控上述过程影响动脉粥样硬化的发生和发展。ZHENG 等[9]研究发现，富含微小RNA-155（miR-155）的外泌体可作用于内皮细胞，通过下调紧密连接蛋白的表达抑制内皮细胞增殖迁移，最终促进动脉粥样硬化进程。FANG等[10]通过对成年猪动脉miR-10 基因位点的处理，诠释了外泌体miR-10 参与动脉粥样硬化内皮细胞促炎表型的调控。TAN 等[11]通过小鼠动脉血栓形成模型发现，来自血小板的外泌体miR-223 可抑制血管平滑肌细胞增殖迁移，从而抑制动脉粥样硬化进程。HERGENREIDER 等[12]在小鼠动脉血栓模型中发现，富含miR-143 和miR-145 的外泌体可导致平滑肌细胞表型改变，发挥抗动脉粥样硬化作用，减少动脉粥样硬化面积。此外，通过调节特定外泌体的表达，如上调外泌体miRNA-146a[13]或抑制外泌体miRNA-302a[14]的表达，不仅可以减轻炎症反应，而且可以缩小动脉粥样硬化范围。因此，外泌体miRNA 在动脉粥样硬化的进展过程中有着重要作用，这为临床研究动脉粥样硬化的治疗提供了新思路。

2.2 外泌体miRNA 与缺血性心脏病

缺血性心脏病是由多种因素引起的心脏血液灌注不足及供氧减少造成的，心肌持续缺血会导致心肌细胞局部的不可逆性坏死，病情凶险且病死率高。近年来，大量研究已经证实外泌体miRNA 在缺血性心脏病的预测、诊断及预后方面具有重要作用。BOSTJANCIC 等[15]在心肌梗死（myocardial infarction，MI）的患者及动物模型中发现，外泌体源性miR-1、miR-133a、miR-208a 以及miR-499-5p 在外周循环中显著升高，而在小鼠心肌梗死模型的缺血心肌中表达明显降低，提示缺血的心肌组织会将特异性外泌体miRNA 释放到外周循环中，因此，其可作为预测心肌梗死的生物标志物。研究[16]证实，检测外周循环中心肌源性miRNA 的水平（如miR-208a、miR-208b、miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-126、miR-199a 等）对于急性心肌梗死的诊断有极高的价值。除血液样本外，心肌梗死患者及动物的尿液中外泌体miR-1、miR-208 也明显升高[17]，这意味着与血液检查相比，尿液检查作为无创性诊断方法，在心肌梗死诊断中可能具有更大的价值[18]。除诊断及预测价值外，外泌体miRNA也与心肌梗死的预后具有相关性[19-20]。RIBEIRORODRIGUES等[21]发现，缺血心肌细胞中的外泌体miR-143 和miR-222 可以促进内皮细胞增殖和血管形成。SUN 等[22]通过大鼠心肌缺血模型发现，缺血和缺氧条件下外泌体miR-486-5p 可抑制心肌细胞凋亡，这为外泌体源性miRNA 在临床治疗心肌缺血方面提供了新思路。虽然具体机制有待研究，但这为外泌体miRNA 在心肌梗死后心肌修复与血管生成治疗中的应用提供了理论支持。

2.3 外泌体miRNA 与心律失常

心律失常是心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。WANG 等[23]发现，多种外泌体miRNA 在持续性心房颤动和窦性心律患者血浆中存在差异性表达，其中miR-483-5p、miR-142-5p 与心房颤动相关，显示了外泌体miRNA在心房颤动诊断与预后中的巨大潜力。MUN 等[24]则进一步证实了这些差异表达的miRNA 与心房颤动相关的信号传导、氧化应激和纤维化等过程有关。然而，血清miRNA 在心律失常中的变化仍存在争议，这可能与发病类型、个体异质性等有关[25]。

2.4 外泌体miRNA 与心肌病

心肌病是心肌结构或功能异常的一组异质性心肌疾病，表现为心室异常的肥厚或扩张。VANDERGRIFF等[26]报道，在扩张性心脏病的小鼠模型中，心脏干细胞可高表达外泌体miR-22、miR-24、miR-146、miR-210，减少心肌细胞凋亡，为临床改善扩张型心肌病患者的心功能提供了可能。WANG 等[27]将糖尿病大鼠的心肌细胞与内皮细胞共孵育，发现其心肌细胞过表达的外泌体miR-320 影响了内皮细胞的功能，进而影响了心肌细胞的内在保护机制，而敲除miR-320 后结果与之相反，提示miR-320 可能参与糖尿病心肌病的发生发展。但目前针对外泌体miRNA 与心肌病的研究尚少。

2.5 外泌体miRNA 与心力衰竭

心力衰竭是由多种疾病如冠心病、高血压等导致心室泵血功能下降的综合征，是心血管疾病的终末阶段，其风险预测与早期识别成为临床治疗的重点和难点。MATSUMOTO 等[28]在临床研究中发现，心肌细胞外泌体来源miR-34a、miR-194 在急性心肌梗死后心力衰竭的早期阶段明显上升，且含量与代偿期心力衰竭左心室的舒张功能明显相关。在临床研究中，WU等[29]发现扩张型心肌病-急性心力衰竭患者血清外泌体miRNA（miR-92b-5p）含量增加，提示了外泌体miRNA 可以作为扩张型心肌病-急性心力衰竭的诊断标志物。

除诊断价值外，外泌体miRNA 可参与心力衰竭的病理变化，有利于心功能的恢复。BARILE 等[30]通过将心肌梗死后心力衰竭早期患者来源的心脏祖细胞（cardiac progenitor cell，CPC）体外作用于人脐静脉内皮细胞，发现CPC 可高表达外泌体miR-132 和miR-210，分别与促进血管内皮细胞增殖分化和抑制心肌细胞凋亡相关。TIAN 等[31]发现，心肌梗死后心力衰竭患者的心肌细胞可释放外泌体miR-27a 进入靶细胞，介导心脏重塑。因此，外泌体miRNA 在心力衰竭患者的心功能恢复中具有巨大的潜在价值。

3 外泌体miRNA 在法医学中的应用前景

近年来，miRNA 在法医学中的应用已被大量报道[32-33]，其作为各种体液（如唾液、血液、精液等）中的标志物在死因分析和死亡时间推断等方面的重要价值被不断证实[34]。miRNA 在法医学中具有极大的应用优势[34-38]：（1）分子量小，不易受理化因素影响而降解；（2）稳定性好，可耐受死后变化或腐败的影响；（3）结构保守性高，无需鉴别其剪接变体或拼接异构体；（4）灵敏度高，组织特异性强，可通过分析miRNA表达谱进行月经血、精液、唾液等体液来源及器官组织种类的鉴定；（5）细胞外分泌，可分泌到体液中并远隔发挥作用；（6）检材易获取，不依赖于心肌组织检材。近年来，有许多法医学研究报道miRNA 可以用于心血管疾病导致死亡的诊断[39]。然而，目前关于外泌体miRNA 在法医学鉴定中的应用还局限于初步探索阶段。研究表明，心包液[40]、脑脊液[41]等生物检材中也含有外泌体，且因其在法医学鉴定中相较于临床上更易获取的优势，其法医学应用价值被不断研究。此外，外泌体的分离和鉴定目前尚不稳定[42]，尤其是对于存在一定程度腐败的法医学检材的稳定性问题也有待进一步确定。

鉴于上述外泌体及miRNA 的优势，笔者认为：高度稳定性和组织特异性的外泌体miRNA 在死因分析、体液鉴定等方面体现出巨大的应用潜力，且随着技术升级和模型优化，其灵敏度、特异性等优势可为法医学鉴定尤其是具有一定死后变化尸体的法医学鉴定提供参考依据，进一步探索外泌体miRNA 在心血管疾病中的价值，也可为心脏性猝死的法医学鉴定提供客观依据。