我国猪圆环病毒的分类、流行现状及分子生物学检测方法研究进展

李天芝，于新友，李 峰

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600 ；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪圆环病毒病是由圆环病毒（porcine circovirus，PCV）感染后引起的一类疾病，各日龄和品种猪均可发生，其中仔猪和母猪受到的危害严重。猪圆环病毒病发病率高，分布广泛，在世界主要养猪国家均有发生和流行，给我国养猪业造成了严重的经济损失。PCV属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒粒子呈二十面体对称[1]，无囊膜，直径大小约13～25 nm，是最小的动物病毒之一。病毒基因组为单股负链环状DNA，大约2 000 bp。PCV对外界环境抵抗力很强[2]，对酒精、氯仿、碘酒等脂溶性消毒剂以及酸碱等具有一定耐受力。在56 ℃环境能存活，82 ℃环境中15 min才被杀灭。消毒剂可选用苯酚、氢氧化钠和氧化剂等。PCV可分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）及猪圆环病毒4型（PCV4）4种类型[3]。

1 猪圆环病毒分类及流行现状

1.1 猪圆环病毒1型

PCV1于1974年首次被报道[4]，存在于PK-15培养物中，但不产生细胞病变，1982年才被证实为一种病毒。PCV1基因组结构与PCV2类似，在研制嵌合病毒疫苗时以PCV1作为载体，构建存在PCV2 ORF2基因的嵌合病毒。PCV1 基因组大小为1 758～1 760 bp， PCV1和PCV2核苷酸序列有76%以上同源性，在猪群中混感现象普遍，仔猪经PCV1感染后可在肺脏、肠道等组织中检测到，因此，PCV1具有一定的潜在致病性。PCV1可以在猪肾细胞、多种猪源细胞系中复制，也可以在Vero细胞中复制，但在Vero细胞中传代时间的延长会导致病毒的抗原改变。

1.2 猪圆环病毒 2型

PCV2于1998年首次被报道，广泛存在于世界各地猪场中，具有较强的致病性。可导致猪只多种疾病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍综合征（SMIJDI）、猪呼吸障碍综合征（PRDC）、先天性震颤（CT）等。PCV2可在猪肾细胞系中复制，且能引起明显的细胞病变。PCV2 基因组大小为 1 766～1 769 bp，根据Cap基因序列差异，PCV2可分为8个基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h[5]，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d型流行广泛，PCV2a为2000年的优势基因型，随后，PCV2b基因型成主流病毒，当前PCV2d基因型在猪场流行增多。

金喜新等[6]对来自河南省12个不同地区的250个疑似PCV2感染送检样品进行检测，结果发现总体阳性率为91.20%。河南东部、西部、南部、北部、中部地区部分养猪场PCV2的阳性率分别为81.82%、90.70%、89.66%、96.30%和93.75%。不同规模养猪场的PCV2阳性率也存在差异，大型养猪场、中型养猪场、小型养猪场的PCV2阳性率分别为94.19%、92.68%和86.59%。万云等[7]对采自湖北省武汉市22个大型规模化猪场的330份猪口腔液样本进行检测，结果发现，8个场的55份样本检出PCV2核酸阳性，场群表观流行率为36.4%，真实流行率为38.0%。 连慧香等[8]对2015—2018年豫南地区157份疑似PCV2感染的组织样品进行PCR检测，并对部分PCV2阳性样品进行了全基因组克隆测序和序列分析。结果显示，43份为PCV2阳性，阳性率为27.39%，对部分阳性样品进行克隆测序获得了13株全基因组序列。经序列比较和遗传进化树分析，结果发现，13株豫南株中有1株属于PCV2a， 2株属于PCV2b，10株属于PCV2d。 罗弼豪等[9]对2018—2019年采自陕西省咸阳和杨凌地区生猪屠宰企业的300份血样进行PCV2病原学检测，结果显示，38份血样PCV2病原学检测为阳性，阳性率为12.67%。颜友荣等[10]对苏中地区未免疫PCV2 疫苗的15个猪场进行PCV2病原检测，结果发现，PCV2阳性率为 10.7%，其中大、中、小型猪场病料PCV2 阳性率分别为 4.9%、7.1%、18.8%。

1.3 猪圆环病毒3型

2016年，美国学者首次报道了患病猪体内PCV3的存在，随后波兰、意大利、韩国、瑞典和俄罗斯等相继有病毒存在的报道。但回溯性研究表明，最早的PCV3感染病例可追溯到1966年，甚至更早。由于PCV3临床症状与PCV2类似，且存在一定的混感，易被忽视。PCV3发生无明显的季节性，可感染所有年龄的猪，会侵害猪免疫系统，致猪免疫能力下降，临床可表现为发热、厌食、母猪繁殖障碍，皮肤出现多灶性丘疹和斑疹。能够水平和垂直传播，猪对PCV3具有高度易感性。病猪和隐性感染猪是主要传染源。PCV3感染率的高低与猪体的健康状况相关，病猪中的阳性率明显高于健康猪，感染PCV3猪所有组织中均可检测到PCV3，尤其是脑组织、肺部、扁桃体、淋巴结、肾脏等组织器官。PCV3还可以跨物种传播，犬、牛、小鼠、狍及岩羚羊等多种动物可感染，但不会出现明显的临床症状及病变。PCV3 基因组相对较大，约为 2 000 bp，GC 含量为 50%，包含3个主要的开放阅读框（ORF）：ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF1编码复制酶蛋白Rep，ORF2编码衣壳蛋白Cap，ORF3编码未知蛋白。PCV3可分为PCV3a、PCV3b和PCV3c 3种基因型。PCV3可在猪原代肾细胞和PK-15细胞系细胞质内增殖，但不产生细胞病变。

张帆帆等[11]对2016—2017年江西省256份样品进行PCR检测后发现，PCV3感染率为1.17%。温海京等[12]对2018—2019年京津冀地区120份仔猪样品进行PCR检测后发现，PCV3感染率为40.8%。刘相聪等[13]检测来自华南地区177家猪场的1 078份样品后发现，华南地区的猪场也存在PCV3，猪场阳性率为4.6%，而样品阳性率为29.04%。肖兴等[14]用PCR方法检测了湖南省与京津冀地区523头断奶仔猪血清样品中的病毒核酸。结果显示，猪圆环病毒3型的猪场核酸阳性率为68.75%，个体阳性率为31.74%，整体存在极显著差异（P<0.01）。进一步分析发现，病毒核酸阳性率超过20%的猪场达到50%，超过70%的猪场占18.75%，为0的猪场占31.25%。

1.4 猪圆环病毒4型

PCV4 是 2019 年在我国湖南省患呼吸道、消化道疾病和 PDNS病猪群中首次被检测出，其基因序列与PCV1～3 型差异明显。回顾性研究表明，国内PCV4最早出现于2017 年。PCV4 基因组大小为 1 770 bp，包含 12 个ORF，其中 ORF1 和ORF2 为主要的ORF，ORF1编码Rep蛋白，ORF2编码 Cap蛋白，基因组与其它 PCV 的核苷酸相似性为 43.2%～51.5%。与 PCV2 和 PCV3 相似，PCV4也是导致猪 PDNS 和 PMWS 的病原体。病猪和隐性感染猪是主要传染源，PCV4随感染猪的鼻液、粪便、唾液等排出体外，污染饲料、饮水及周边环境，并经消化道、呼吸道等水平途径传播，此外，还可以通过垂直方式由母猪传给仔猪。

Tian等[15]于2018年2月至2019年12月对63份采自河南省和山西省的24个不同猪场的临床样本进行PCV4检测。结果显示，PCV4猪场阳性率为50%，样本阳性率为25.4%。

Zhang等[16]将2019年3—12月间从中国安徽省收集的42头临床症状为呼吸系统疾病、皮肤病和腹泻的病猪进行PCV4筛查。结果显示，实时PCR的阳性检出率为10.71%。何世成等[17]对来自湖南省14个市州的821份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品进行PCV4荧光PCR检测。结果显示：在821份样品中，PCV4阳性检出率为1.10%。

2 分子生物学检测方法

2.1 常规PCR

PCR检测方法是针对病原核酸的一种检测方法，借助引物与相应的酶试剂和反应液等体外扩增病原核酸，实现病原检测，敏感性高、特异性好，已经广泛应用于动物疾病检测领域。王林青等[18]参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列，针对其保守区分别设计了2对特异性引物，建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法。结果表明，该方法能同时特异地检测PCV2和PCV3，而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号，PCV2和PCV3的最低检测值分别为41.1拷贝/μL、27.0拷贝/μL，批内和批间变异系数均小于1%。徐通等[19]参考GenBank中PCV2和PCV4基因组序列，分别在PCV2 Rep和PCV4 Cap基因高度保守区设计2对特异性引物，经双重PCR条件优化，建立同时快速检测PCV2/4的双重PCR方法。该方法能同时扩增出264 bp（PCV2）和391 bp（PCV4）2条特异性片段，而对其他8种常见猪病原扩增均为阴性，PCV2/4的最低检测量分别为61.1、54.9拷贝/μL。

2.2 荧光PCR

荧光PCR是在PCR基础上发展起来的一种核酸检测技术，后续不需要电泳检测扩增产物，可直接根据扩增曲线判定结果，还能实现病原定量检测，敏感性更高，具有很好的特异性，封闭检测，降低实验室气溶胶污染风险，可分为染料法和探针法两种。骆辉等[20]根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针，通过对反应体系和扩增条件进行优化，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法对7.87×103～7.87×109拷贝/μL的PCV3标准质粒呈现良好的线性关系，最低检出浓度为7.87×101拷贝/μL，比常规PCR的灵敏度高100倍。与PRV（伪狂犬病病毒）、PCV2、PPV（细小病毒）、PRRSV（蓝耳病病毒）、JEV（乙型脑炎病毒）、TGEV（传染性胃肠炎病毒）和PEDV（猪流行性腹泻病毒）均无交叉反应，具有良好的特异性。不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验结果均显示变异系数小于1%，重复性较好。吴江等[21]根据PCV2和PCV3保守区域基因序列，设计2对特异性的引物和2种TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化，建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。该方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3，且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA（A型塞内卡病毒）病毒核酸没有交叉反应。灵敏性强，PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1拷贝/μL和58.3拷贝/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5%，重复性好。田瑶等建立了一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别检测方法，结果表明：检测下限分别为PCV1：40.3拷贝/μL、PCV2：25.2拷贝/μL、PCV3：22.4拷贝/μL。与CSFV、PRRSV、PRV、PPV均无交叉反应，批内及批间变异系数均小于1%。张倩等[22]参照GenBank收录的PCV4 ORF2基因保守序列，设计合成了1对特异性引物和TaqMan探针，建立了针对PCV4的实时荧光PCR方法。结果显示，该方法的Ct值与标准品在1.53×103～1.53×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系，R2值为0.999，特异性强，仅对PCV4呈特异性扩增，与PCV1、PCV2、PCV3以及其他多种猪常见病原均无交叉反应，敏感性高，最低检测限为1.53×101拷贝/μL，重复性好，组内、组间变异系数均小于2%。

2.3 微滴式数字PCR

微滴式数字PCR技术是在扩增前先对反应体系进行微滴化处理，使得反应体系分成数万个纳米级微滴，每个微滴含不同量待检核酸靶分子，每个微滴就是一个独立的反应体系。根据泊松分布的原理以及出现荧光信号的微滴个数与比例，可实现靶分子的绝对定量检测。最低可检测单拷贝待检靶核酸分子。吴朦晨等[23]针对PCV2 ORF1基因设计引物和探针，经各反应条件的优化，建立检测PCV2的微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR）检测方法。该方法除了对PCV2检测结果为阳性外，对PCV1、PCV3和其他常见猪病病原的检测均未见阳性微滴，特异性较强。对10倍倍比稀释的重组质粒标准品检测敏感性试验，结果显示最低检测限达2.93拷贝/μL，比荧光PCR高10倍以上，敏感性较高。批内和批间重复性试验结果显示，其变异系数均小于10%，重复性较好。

2.4 恒温扩增技术

恒温扩增技术较PCR检测技术最大的优势是不需要复杂的仪器设备，仅用水浴锅即能实现核酸体外迅速大量扩增，当前成熟的恒温扩增检测技术主要有环介导等温扩增（LAMP）和重组酶介导等温扩增方法（RAA）。谢志勤等[24]根据CSFV E2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域，分别设计并合成了2组特异性引物和2条探针，建立了同时检测CSFV和PCV2的二重荧光LAMP检测方法区分，对该方法中的反应体系进行优化，并进行特异性、敏感性和干扰性测试以及临床样品验证测试。结果表明，建立的方法可鉴别CSFV和PCV2，特异性试验显示，该方法只检测出CSFV或PCV2，且与参试的对照病毒无交叉反应，特异性好。该方法最低检测CSFV或PCV2为100拷贝/μL，敏感性好。临床样品的检测结果与荧光定量PCR检测结果一致。建立的CSFV和PCV2二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性，可适用于CSFV和PCV2的鉴别检测。 姜辰龙等[25]根据PCV3 ORF2基因保守序列，设计特异性引物，建立了PCV3 LAMP检测方法。结果显示，59 ℃恒温扩增36 min即可出现梯形条带，且产物亦可通过SYBR Green Ⅰ染色进行判断。该方法最低检测限为1.0×101拷贝/μL，与PRRSV、PRV、CSFV、PCV1及PCV2等均无交叉反应。田瑶等[26]根据GenBank公布的PCV1全基因组序列，在其保守区设计了4条特异性LAMP引物，并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测，首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明，62 ℃水浴60 min为最佳反应条件，LAMP的检出限为1×101拷贝/μL，普通PCR最低检测限为1×103拷贝/μL，对PPV、PRV、PCV2、PCV3进行扩增，结果显示为阴性。吴江等[27]根据PCV3 Cap基因的保守序列设计引物和探针，建立了一种实时荧光RAA检测方法，结果表明仅能扩增PCV3核酸，与CSFV、PRRSV、PCV2、SVA和FMDV（口蹄疫病毒）等核酸无交叉反应，可在39 ℃下20 min内快速特异完成，方法灵敏度较高，最低检出浓度为102拷贝/μL。

3 小结

猪圆环病毒病是危害世界养猪业最重要的一种疾病，病原种类较多，基因组结构差别大，宿主范围广泛，多种动物均有检出。猪群中常见的圆环病毒有4种，PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，目前认为除PCV1外均能对猪致病，可导致猪只免疫机能受损，对疫苗免疫应答保护力减弱，免疫常规疫苗后效果不理想，料重比升高，生长发育不良，易继发细菌感染，母猪可表现为繁殖障碍如流产、死胎等，是影响猪场效力的重要疾病。

目前，临床对PCV病原检测主要采用分子生物学方法，常用的分子生物学方法有常规PCR方法、荧光PCR方法、微滴式数字PCR方法和恒温扩增检测方法。这些检测方法各有利弊，不同单位可根据自己实验室条件选择。其中常规PCR方法是最简单、最常用的方法，相对来说检测费用低，但后续需要电泳检测产物，存在实验室核酸气溶胶污染风险，检测耗时长，敏感性不够高。荧光PCR方法检测敏感性高，可实现定量检测，全封闭操作，污染实验室风险降低，但费用相对较高，需要昂贵的检测设备。微滴数字PCR无需标准曲线，最低可检测单拷贝核酸分子，对待检靶样品核酸可实现绝对定量，但对操作人员要求高，仪器昂贵，不适合基层检测。恒温扩增检测技术，操作简单，不需要复杂仪器设备，适合基层猪场实验室应用，但当前试剂价格昂贵，检测成本高，引物设计复杂。

科学防控猪场圆环病毒病，可提高猪场养殖效益，目前仅有针对PCV2的商品化疫苗，种类包括猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（1010株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（YZ株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（WH株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（DBN-SX07株），猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C株），猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（CP08株），猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗，猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗（Cap蛋白+SY株），猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗（重组杆状病毒CP08株+JM株），猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗（SH株+HN0613株），猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗（SH株+4型JS株+5型ZJ株），猪圆环病毒1-2型嵌合体灭活疫苗，猪圆环病毒1-2型嵌合体、支原体肺炎二联灭活疫苗，猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗（重组杆状病毒P株+P株）。目前公认猪场免疫PCV2疫苗后会产生良好的效果，但疫苗品种多达10多种，价格差别大，很难选择，猪场选择疫苗时一定要慎重，可选择性价比高、口碑好的疫苗。有条件的猪场可选择几种疫苗进行小群试验，全面评估猪群生长情况及用疫苗后猪场生产成绩的改变。目前尚无针对PCV3和PCV4的疫苗，猪场只能采取综合防控措施，加强饲养管理，提供优质饲料和清洁饮水，定期补充维生素和微量元素，提高猪群自身免疫力。强化生物安全管理，加强消毒，避免病毒传入场内及在场内扩散传播。降低猪群饲养密度，减少猪群应激，提供适宜温度，加强通风。严禁从疫区引种及购买带毒精液，新引进猪只隔离饲养1个月，检测合格后再并入大群饲养。