替代活化型巨噬细胞在胰腺纤维化中的作用研究进展

吕彦玮 王丽娟 李兆申

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎是一种以胰腺纤维化为主要病理特征的慢性进展性疾病，以巨噬细胞为代表的免疫细胞在其发生和发展过程中发挥重要作用。在胰腺纤维化进程中，巨噬细胞以替代活化型(M2型)为主，可通过分泌大量抑炎和促纤维化因子改变组织纤维化-炎性微环境；分泌多种基质金属蛋白酶及其抑制剂等影响细胞外基质降解与重塑；分泌TGF-β、PDGF等促细胞生长和增殖因子调控胰腺星状细胞活化状态，并可与之协同作用共同促进胰腺纤维化进程。本文旨在对M2型巨噬细胞在胰腺纤维化中的作用进行综述，为以巨噬细胞为靶标的慢性胰腺炎相关治疗提供理论基础。

CP是由遗传、环境等多种因素引起的以胰腺组织弥漫性纤维化为特征的慢性进展性疾病[1-2]。大量研究表明胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)是胰腺纤维化最主要的效应细胞。但近年研究发现以巨噬细胞为代表的免疫细胞可通过改变组织纤维化-炎性微环境、影响细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解与重塑以及调控PSCs活化状态等机制在胰腺纤维化进程中发挥重要作用[3]。巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，在免疫调节、稳态维持以及组织损伤修复等过程中发挥重要作用[4]。巨噬细胞具有高度可塑性和多能性，在不同刺激条件下可发生不同类型极化，根据Gordon[5]提出的分类方案，可将其分为经典活化型和替代活化型。经典活化型又称M1型，由LPS和(或)IFN-γ诱导发生，以产生活性氧和一氧化氮(NO)等物质为特征，主要发挥促炎和免疫监察功能。替代活化型又称M2型，由IL-4和(或)IL-13诱导发生，以细胞表面表达清道夫受体CD206为特征，具有抑炎、促组织损伤修复和促纤维化等作用。Sica等[6]认为，巨噬细胞M1型和M2型极化是其两个极端状态，其间存在不同极化状态细胞共存现象，即其极化状态是连续动态变化的。

不同极化类型的巨噬细胞具有显著的特征性和功能性差异，在CP中以M2型极化为主，可通过分泌TGF-β、PDGF和IL-10等细胞因子影响PSCs活化和增殖，并分泌多种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)等影响ECM降解和重塑，从而参与调控胰腺纤维化进程[7]。目前已有大量综述对巨噬细胞在AP中的作用进行总结阐述[8-9]，但针对胰腺纤维化进程中巨噬细胞的特性功能及其与PSCs间相互作用的研究较少，笔者所在团队前期研究发现巨噬细胞与PSCs之间存在密切信号交流和协同活化，单独抑制一种细胞活性无法有效阻滞胰腺纤维化进程[10-11]。因此，本文聚焦于M2型巨噬细胞在胰腺纤维化中作用的研究进展进行综述，为CP的免疫治疗提供理论依据。

一、M2型巨噬细胞在胰腺纤维化中的作用

在CP病程中，若胰腺损伤性因素持续存在或反复发生，可造成胰腺组织持续性炎症反应以及免疫调节性细胞如Th细胞分化失衡，引起组织微环境中IL-10、IL-4 和 IL-13 等抑炎和促纤维化因子累积增多，促进PSCs持续过度活化和巨噬细胞M2型极化；二者相互作用可分泌大量ECM成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤连蛋白(fibronectin, FN)以及多种MMPs、TIMPs等影响ECM降解与重塑，最终导致胰腺纤维化的发生。

通常可作为巨噬细胞M1型极化的相关标志物有iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、CD80和CD86等，而M2型极化特征性标志物包括CD206、CD301、ARG1、YM1、IL-10和TGF-β等[6,12]。由于巨噬细胞的极化状态是连续动态变化的，处于两种典型极化类型之间的巨噬细胞可能同时表达M1型和M2型极化相关标志物。Xue等[3]对从CP小鼠胰腺中分离的单核或巨噬细胞进行相关极化标志物基因表达检测，结果显示，与对照组小鼠相比，CP小鼠来源的巨噬细胞M2型标志物基因如YM1、CD206、CD301、IL-10和TGF-β等的表达水平均明显上调；流式细胞检测亦证实M2型相关标志物表达量显著上升，而M1型相关标志物MHC-Ⅱ和TNF-α下降或不变，表明在胰腺纤维化过程中M2型巨噬细胞占主导地位。已有多项研究证实，通过抑制巨噬细胞M2型极化可以显著缓解CP小鼠胰腺纤维化。研究发现通过封闭肽阻断IL-4或IL-13诱导巨噬细胞M2型极化，或在巨噬细胞内敲除其相应受体IL-4Rα，均可显著抑制CP小鼠胰腺纤维化[3]；Wang等[13]研究显示成纤维细胞生长因子21可通过抑制巨噬细胞胰腺组织浸润和M2型极化来减轻CP小鼠胰腺纤维化程度；笔者所在团队前期研究也发现达沙替尼(Dasatinib)可通过抑制巨噬细胞M1、M2型极化来缓解小鼠胰腺纤维化[10]。

二、胰腺纤维化进程中M2型巨噬细胞的来源

胰腺组织中巨噬细胞来源主要包括组织驻留的巨噬细胞和从血液中募集而来的单核或巨噬细胞。其中组织驻留的巨噬细胞主要由胚胎形成期的卵黄囊及胎儿肝中的前体细胞分化而来[14]。Calderon等[15]研究表明，正常生理条件下，胰腺外分泌部驻留的巨噬细胞(F4/80+CD11b+)中约有半数细胞表达CD206和CD301，即呈M2型极化表型；而血液来源的单核或巨噬细胞起源于骨髓造血干细胞，经历髓系祖细胞、粒细胞-单核细胞前体、单核-树突状细胞前体等一系列分化后进入血液循环系统，迁移至外周组织或器官发育成熟[12]。当胰腺组织发生损伤时，其中驻留的巨噬细胞会被激活，释放多种促炎和趋化因子，大量募集血液中的单核细胞至胰腺损伤部位，经一系列转变分化为巨噬细胞。此时，这些巨噬细胞以发生M1型极化为主，释放多种促炎性细胞因子、趋化因子和MMPs等物质级联放大炎症反应[16]。随着CP病程的进展，组织损伤修复失调以及PSCs持续过度活化，将导致IL-10、IL-4和IL-13等抑炎和促纤维化因子在组织微环境中积累增多，巨噬细胞也逐渐转变为以M2型极化为主。

关于胰腺纤维化进程中M2型巨噬细胞的来源问题，目前尚无统一定论。一些学者研究认为其可能由急性炎症期的M1型巨噬细胞转化而来。Hashimoto等[17]在二丁基二氯化锡(DBTC)诱导的大鼠胰腺纤维化模型中研究证实，胰腺纤维化发生时胰腺组织浸润的巨噬细胞有约44%共表达CD68/CD163，提示在胰腺纤维化过程中存在巨噬细胞由M1型向M2型转化的现象；Wijesundera等[18]在大鼠肝硬化模型中也发现存在巨噬细胞M1型向M2型转化的现象。然而，也有研究提示其可能由从血液中招募的单核细胞直接分化而来。Wu等[8]研究发现，与CCR2基因敲除小鼠相比，CCR2野生型小鼠胰腺组织中的巨噬细胞具有更高的CD206及IL4RA表达水平。CCR2是单核或巨噬细胞等髓源免疫细胞表面表达的重要趋化因子受体，可在相应趋化因子CCL2的浓度梯度引导下帮助相应免疫细胞到达组织炎症部位[19]。因此，CCR2表达与否可用于区分组织内原本驻留的巨噬细胞(CCR2-)和由血液中单核细胞转化而来的巨噬细胞(CCR2+)。上述研究结果提示，在小鼠胰腺纤维化过程中M2型巨噬细胞主要来源于早期被招募至炎症区域的CCR2+单核细胞。此外，鉴于前述有研究显示，正常生理条件下，胰腺外分泌部驻留的巨噬细胞中约有半数细胞呈M2型极化，这部分细胞虽然起始数量较少，也可能是胰腺纤维化中M2型巨噬细胞的来源之一。关于该问题以及巨噬细胞M1型至M2型的具体转化机制等还需要更多实验研究进一步证实。

三、M2型巨噬细胞促进胰腺纤维化的分子机制

1．自身特性：大量研究已表明，M2型巨噬细胞可分泌TGF-β、PDGF、IL-10等抑炎和促纤维化因子改变胰腺组织纤维化-炎性微环境，还可分泌MMP-2、9、13，TIMP-1、2、3以及其他蛋白酶类等成分影响ECM降解与重塑，参与调控胰腺纤维化进程[20-22]。

Legumain(Lgmn)是一种属于半胱氨酸蛋白酶C13家族的天冬酰胺内肽酶[23]，有研究显示其在CP患者胰腺组织中表达显著上调[24]。Wang等[25]在肾间质纤维化模型中的研究表明，Lgmn主要高表达于CD206+M2型巨噬细胞。Ren等[26]研究表明，Lgmn可通过激活ECM中的TGF-β1活性促进胰腺纤维化进程，且在体外使用IL-4或IL-13处理可刺激巨噬细胞分泌Lgmn，提示M2型巨噬细胞是胰腺纤维化中Lgmn的主要来源；此外，他们还分别使用野生型小鼠、Lgmn全身敲除小鼠和Lgmn髓系条件性敲除小鼠构建雨蛙素诱导的CP模型，发现Lgmn表达水平在CP小鼠的血清和胰腺组织中均发生上调；且与野生型小鼠相比，Lgmn全身敲除及髓系条件性敲除小鼠的胰腺纤维化程度显著减轻，进一步证实M2型巨噬细胞可通过分泌Lgmn影响ECM中TGF-β1的活性，从而参与调控胰腺纤维化和CP进程。

此外，Qi等[27]研究发现M2型巨噬细胞还可通过分泌S100A4(一种分泌型S100家族钙结合蛋白，在多种纤维化组织器官中高表达)参与调控肺组织成纤维细胞活化和ECM重塑过程。Savitri等[28]在皮肤伤口愈合模型中的研究发现，M2型巨噬细胞来源的培养上清能显著加快伤口部位胶原合成、胶质细胞成熟和创口愈合，证实了M2型巨噬细胞分泌的多种细胞因子和趋化因子(如CCL5、CCL1、G-CSF等)对ECM重塑和组织创伤修复的重要作用。可见，M2型巨噬细胞是ECM重塑、组织损伤修复以及纤维化等生理或病理过程的重要调控者。

2．M2型巨噬细胞与PSCs的相互作用：PSCs是胰腺纤维化的主要效应细胞，其活化为胰腺纤维化初始阶段最重要的胞内事件[29]。PSCs在正常情况下处于静息状态，当胰腺发生损伤时可被病灶部位产生的各种损伤相关模式分子以及浸润组织的各种免疫细胞所释放的多种促炎因子激活。活化后的PSCs增殖活跃，高表达α-平滑肌蛋白并可分泌大量Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN等ECM成分，参与组织修复；倘若修复过程出现异常，PSCs持续过度活化则可导致纤维化的发生[30]。

已有研究表明，CP患者和CP小鼠胰腺中均存在大量M2型巨噬细胞。Xue等[3]将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)与从CP小鼠中分离的PSCs共培养，发现BMDM胞内IL-10、TGF-β、CD206和CD301等mRNA转录水平均显著升高，提示与活化的PSCs共培养可促进巨噬细胞发生M2型极化；进一步研究证实PSCs是通过分泌IL-4或IL-13来促进巨噬细胞M2型极化的。此外，Shi等[31]将人源性PSCs系(IPS-1)分别与RAW 264.7和BMDM两种不同巨噬细胞进行体外共培养，结果显示，IPS-1细胞发生活化，产生片状或丝状伪足等形态学改变，提示巨噬细胞反过来也对PSCs活性产生一定影响。大量研究亦表明M2型巨噬细胞可通过分泌TGF-β、PDGF等细胞因子促进PSCs的增殖与活化[30,32]。

Treiber等[33]对巨噬细胞中NF-κB信号通路的关键转录因子RelA/p65行基因敲除后发现，巨噬细胞中产生的多种促炎因子明显下调，胰腺纤维化程度亦显著减轻，提示p65的表达对巨噬细胞活化和胰腺纤维化过程起重要调控作用。而Wu等[34]在PSCs中使用p65 siRNA对p65基因表达进行敲低处理，结果显示与对照组相比，p65 siRNA处理组PSCs的培养上清可显著抑制BMDMs迁移及MCP-1的产生，说明PSCs诱导巨噬细胞胰腺迁移的过程与p65的表达和活性相关。RelA/p65是NF-κB信号通路中参与调节炎症、细胞增殖及凋亡的关键性转录因子[35]。上述研究表明NF-κB信号通路在巨噬细胞与PSCs间相互作用以及胰腺纤维化进程中发挥重要作用。

四、总结与展望

综上所述，在胰腺纤维化进程中，M2型巨噬细胞占主导地位，且其与PSCs间存在协同活化作用。一方面，活化的PSCs可通过分泌IL-6、CCL2等趋化因子招募血液中单核细胞向胰腺组织迁移，还可通过分泌IL-4、IL-13等细胞因子促进已浸润胰腺的单核或巨噬细胞向M2型极化；另一方面，M2型巨噬细胞亦可通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子以及Lgmn和S100A4等蛋白酶和信号分子影响PSCs的活化和增殖，且二者间的相互调控机制可能与NF-κB信号通路有关。M2型巨噬细胞与PSCs的协同活化作用通过合成并分泌大量促纤维化因子以及FN、胶原等ECM成分到组织微环境中，促进ECM重构和累积，最终加剧胰腺纤维化进程。未来还需要进一步深入研究胰腺微环境中各种不同类型细胞活性状态和理化因子成分对巨噬细胞组织迁移和极化的影响，以及巨噬细胞对胰腺微环境的反调控作用和分子机制，为CP治疗提供基础免疫相关思路。

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