淋巴系统再生医学与组织工程的研究进展

杜奉舟 龙笑

【提要】 各种原因导致的淋巴系统损害仍然是临床亟待解决的难题。再生医学和组织工程技术的发展为淋巴系统修复开辟了重要的途径。近年来，对淋巴系统生理的理解逐渐深入，淋巴系统再生医学展现出许多新的重要进展，包括细胞因子的应用、支架系统的开发、细胞疗法、组织工程淋巴系统的构建等。本文将对淋巴系统再生医学、组织工程的现状及其最新进展进行综述。

淋巴系统在维持内环境稳态中发挥着不可替代的作用。淋巴水肿是淋巴系统因各种原因受到破坏以后，组织间液回流受阻，进而引起组织肿胀，继发慢性炎症，严重影响患者的生存质量。目前，针对淋巴水肿最常用的治疗方法是物理治疗，通过非手术方法促进组织间液回流[1]。这些疗法不但需要长期规律地维持，而且无法重建损伤的淋巴管系统。手术治疗，包括建立淋巴管旁路、淋巴管－静脉吻合、血管化淋巴结移植等，有可能重建淋巴回流通路。随着显微外科技术的发展，淋巴管吻合的成功率得以提高[2]。但手术可能导致供区损伤，甚至引发供区淋巴水肿。

组织工程与再生医学研究的高速发展，包括组织工程淋巴回流系统、生长因子的递送、细胞治疗、基因编辑等再生医学领域的最新成果，均为淋巴管重建提供了新的途径。本文将综述近年来再生医学在淋巴水肿中的最新进展。

1 淋巴系统的发生和生理

淋巴系统起源于静脉，在胚胎期的第1 到7 周由前主静脉出芽形成[3-4]。淋巴管相关基因的表达，如PROX-1、LYVE-1、VEGFR3 等，对于淋巴管结构的分化和形成起到了关键作用[5]，同时也成为鉴别与分离淋巴内皮细胞的标记之一。淋巴系统的起始由一侧盲端膨大的淋巴毛细管广泛分布、吻合组成。作为淋巴系统营养吸收的基本单元，毛细淋巴管由单层淋巴内皮细胞组成，借助微丝与胞外基质相连接固定，相较毛细血管缺少平滑肌、内皮细胞、周细胞及连续的基底膜覆盖[4]。淋巴集合管从毛细淋巴管丛延伸汇集而来，具有相对完整的基底膜和平滑肌覆盖。淋巴集合管还具有方向瓣膜，在淋巴管平滑肌及相应部位骨骼肌收缩时，避免由于淋巴液汇集导致的反流[6]。淋巴集合管会进一步合成淋巴干及淋巴导管。淋巴系统在沟通血管和调节循环体液平衡方面有着重要作用。病理条件导致的淋巴管障碍、淋巴液潴留、胞外基质重塑及脂质沉积等，均会影响淋巴管的功能及再生，引起淋巴性水肿[7-8]。

2 促进淋巴管再生的生长因子及其应用

血管内皮生长因子（VEGF）C 和D 及其受体VEGFR-3介导了调节淋巴管再生的主要信号通路[4]，并在一系列体内/外试验中得到效果验证。在先天淋巴管缺乏导致的淋巴水肿耳模型中，真皮层注射VEGF-C 表达的腺病毒可有效促进淋巴管的出芽和生长[9]。此外，通过重组蛋白、转染病毒载体及质粒等方法补充VEGF-C 蛋白表达，可在兔、小鼠、大鼠、羊等多种动物模型中促进皮瓣切口淋巴组织再生[10]，提高淋巴结移植治疗淋巴水肿的效果[11-12]。除VEGF-C 外，其余血管生长因子，包括FGF（诱导淋巴管生成）、HGF（独立于VEGF 机制外的促淋巴管增殖）、IGF（刺激淋巴内皮细胞增殖及迁徙）、PDGF、EphB4（调控淋巴管的重塑及瓣膜形成）等，在淋巴管再生方面的报道较少，需要进一步的研究证实。

除了对于促进淋巴管修复效应因子的研究外，对于抗淋巴管再生的机制探究，也是该领域的关键问题。在某些病理条件下，淋巴管功能障碍并不伴淋巴管相关效应因子表达异常，提示存在其他机制直接或间接地介导了淋巴管再生障碍过程。在鼠尾淋巴水肿模型中，内源性及依赖细胞的VEGFC 因子过表达，不足以促进足够的淋巴系统再生，而同一模型中加入对TGF-β 的局部或系统抑制，可显著促进淋巴管修复[13]，符合既往TGF-β 抑制淋巴内皮细胞增殖、迁移及淋巴管形成的相关报道[14]。上述研究表明，淋巴管再生是由促修复机制与抑制修复机制的平衡决定的。VEGF-C 也被报道了不良反应，包括对于肿瘤治疗引起的继发淋巴管损伤，在修复淋巴水肿的同时可能促进肿瘤新生血管形成，以及由于新生淋巴管结构功能不良导致淋巴性水肿的加重等[15]。因此，在特定情况下，抑制抗淋巴管修复的机制可能是一种更好的选择。近期的报道指出，相关分子，包括IFN-γ、内皮素等，均在鼠尾水肿模型中显示出类似TGF-β 的抗淋巴管再生作用。这些研究展示了通过影响淋巴管再生轴调控促淋巴系统修复的可能性。

3 淋巴组织再生中的细胞疗法

3.1 淋巴内皮细胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）

淋巴内皮细胞是淋巴毛细管网的主要组成部分。因此，在淋巴管再生中，LECs 被视为增加细胞数量最直接的方法[16]。以裸大鼠构建的鼠尾淋巴水肿模型中，注射人LECs 可显著减少肿胀体积，改善大鼠尾部的淋巴毛细血管生长[17]。此外，注射36 d 后在新淋巴毛细血管中检测到了人源细胞，这表明外源性LECs 可以直接参与原位淋巴管生成。LECs 也被用来预构淋巴－血管化组织，有研究证明在体内移植后，组织整合过程得到了加速。虽然治疗有效，但自体LECs 来源有限，而且获得细胞需要侵入性的外科手术。内皮集落形成细胞（Endothelial colony forming cells，ECFCs）可作为LECs 的一种替代。ECFCs 主要来源于外周血和组织中分离出来血管内皮，可在体外大量扩增[18]。最重要的是，有一组ECFCs 可以表达淋巴特异性转录因子，包括Prox-1、LYVE-1、VEGFR-3 和podoplanin[19]。这些细胞可以形成脉管系统，或直接参与体内新生淋巴管[20]。在免疫缺陷小鼠皮下注射ECFCs，细胞整合进入新形成的毛细淋巴管，并促进了血管和淋巴毛细血管生长[21]。

3.2 诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）

由于iPSCs 可以大量产生各种患者特异性细胞，iPSCs是几乎所有类型细胞的潜在来源[22]。iPSCs 可以分化为LECs谱系，并在体外和体内参与形成淋巴毛细血管。当与LECs 共培养时，在新形成的毛细淋巴管中可见iPSC-LECs。体内研究还表明，在裸鼠皮肤伤口愈合模型中注射iPSC-LECs 时，能够通过淋巴管生成和淋巴血管生成来增强伤口愈合。此外，iPSC-LECs 可以减少小鼠尾部淋巴水肿模型中的鼠尾肿胀，这证实了在临床治疗淋巴水肿的应用潜力[23]。值得注意的是，畸胎瘤风险仍然是iPSCs 来源细胞的主要关注点。在iPSC-LEC 的临床应用之前，需要更严格的实验设计和全面检查。

3.3 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs 由于其独特和优越的性质，包括旁分泌效应[24]和免疫调节性质，已被广泛应用于组织工程[25]。MSCs 在损伤部位分泌淋巴管生成因子，如VEGF、HGF、PDGF 和bFGF，可以刺激淋巴管生成[26]。在大鼠后肢及鼠尾模型中，注射脂肪来源间充质细胞可观察到淋巴水肿的缓解、淋巴管的修复等[27-28]。此外，ASC 与淋巴管内皮细胞体外共培养可表现出外周VEGF浓度升高，密集淋巴网络形成等协同作用[29]。这些研究提示了基于可大量获取的脂肪来源干细胞诱导淋巴系统修复，缓解淋巴水肿的可行性，并初步提供了体内试验证据。将兔MSCs悬浮液注射到兔肢体淋巴水肿部位，术后28 d 观察到肢体肿胀改善，淋巴管数量增加[30]。目前，hMSCs 悬浮液注射已被用于治疗淋巴水肿的临床试验中[31]。据报道，乳腺癌相关淋巴水肿患者腋窝区域注射hMSCs，在6 个月后半数患者的保守治疗减少，且没有严重不良反应。hMSCs 的治疗效果主要归因于其旁分泌效应，通过分泌淋巴管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、HEG、FGF 和ANG 等，来刺激淋巴管生成。此外，hMSCs 可以向LECs 样细胞分化，表明MSCs 还直接参与构建新淋巴管系统。尽管MSCs 在治疗淋巴水肿方面显示出巨大的潜力，但其免疫调节和分化特性可能因供体差异而不同。因此，制定系统性策略（如预处理方法等）以增加hMSCs 的稳定性、效力和免疫调节特性，对于改善其临床结果至关重要。

4 淋巴系统再生的支架

三维环境为LECs 生长和形成网状结构提供了框架。因此，由天然或合成聚合物和水组成的水凝胶通常用于组织工程研究。这些水凝胶可以容纳细胞和生物活性物质，同时可以改变其机械性能。为了找到淋巴毛细血管生长的理想水凝胶，Helm 等[32]使用了不同量的胶原蛋白和纤维蛋白原，每种胶原蛋白和纤维蛋白原都具有共价结合的VEGF-121。他们发现，只有纤维基质可以提供合适的环境，能够在共聚焦显微镜下评估毛细淋巴管的形成。然而，在另一项研究中，LECs与成纤维细胞共培养，胶原-Ⅰ基质中毛细淋巴管的密度略高于纤维基质，但并不显著[33]。

Matrigel 也被用于研究LECs 网络，但是通过添加VEGF-C 和/或ADSCs 不能诱 导管形成[34]。Matrigel 是从 小鼠Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤细胞中获得的一种液体基底膜基质，含有多种生长因子。Dai 等[35]设计了基于聚乙醇酸支架的血管内皮细胞移植系统，并在体内试验中进一步探究其对于淋巴管网络形成的作用。与传统方法所用的胶阵不同，该系统保留了支架的硬度和可塑性，更便于术中操作，并且具有良好的生物相容性和降解能力。

多面体硅氧烷寡聚物聚氨酯（POSS-PCU），是一种用于重建气管、泪管、耳和心脏瓣膜的纳米材料。Kanapathy 等[36]将该材料作为支架用于构建组织工程集化合淋巴管，并以人真皮来源的LECs 作为支架内衬。支架在拉伸强度、缝合线保持力和抗扭结性方面表现出良好的机械性能，但其毛细管作用低，且不含任何瓣膜。虽然LECs 黏附良好，但最终并未形成内皮衬里，并且POSS-PCU 上内皮细胞的代谢活性、细胞密度显著低于对照组（玻璃表面）。Wong 等[37]研究了无细胞真皮基质作为生物支架介导的淋巴管内生，证实在无细胞真皮层，血管及淋巴管内皮可迅速再生，形成典型真皮脉管系统结构，且无细胞支架产生了更少的炎症刺激，为无细胞基质作为生物支架，提供脉管系统内生所需结构及刺激因子提供了可行性。

Biobridge 是一种由纳米纤维胶原组成并提供空间结构的支架。Hadamitz 等[38]在猪后肢淋巴水肿模型中探究了Biobridge 在淋巴管生成中的效果。实验分为Biobridge 加淋巴结，Biobridge 加VEGF-C 及对照3 组进行，加入Biobridge 的组显示出更高的移植后支架周围淋巴管密度（100 μm 对比2 000 μm）。另外，CT 及电阻率测定显示，仅Biobridge 加淋巴结组产生了具有功能的淋巴管系统。最新的一项临床前研究显示，在大鼠后肢淋巴水肿模型中，淋巴结切除时就植入Biobridge，可有效避免淋巴水肿的产生，而对于已经产生淋巴水肿的大鼠，移植Biobridge 和脂肪间充质干细胞可减轻淋巴水肿[39]。

5 组织工程化淋巴系统

随着对淋巴系统发生机制和淋巴组织结构认识的深入，体外构建组织工程化淋巴系统成为可能。组织工程化淋巴系统移植可加速损伤组织的功能恢复。目前组织工程淋巴系统研究包括组织工程化毛细淋巴管，淋巴结和集合淋巴管。

5.1 组织工程化毛细淋巴管

体外制备的组织工程化毛细淋巴管比直接使用细胞悬液更有利于加速淋巴系统的修复。研究表明，组织工程化毛细淋巴管移植后可自动与原有淋巴管形成吻合。通过在水凝胶纤维中共培养LECs，内皮细胞和成纤维细胞，可制备出含毛细血管和淋巴管的人皮肤移植物[33]。移植至裸鼠后可观察到移植物中淋巴管与裸鼠的淋巴管网吻合，并可形成淋巴引流。类似的研究还有，采用LECs，内皮细胞，与脂肪来源的基质细胞在纤维支架中共培养，构建形成管网结构[40]。

值得注意的是，近年来无支架的细胞膜片组织工程技术开始兴起。细胞膜片技术不使用胰蛋白酶消化细胞，从而保存了完整的细胞膜片结构，确保细胞间以及细胞和细胞基质之间的连接不被破坏。Gibot 等[41]通过成纤维细胞和LEC 细胞膜片，制备出了含有清晰管腔结构的三维组织，其中成纤维细胞构成微管网结构，同时可产生FGF-2 和VEGF-C，有利于毛细淋巴管的形成。相比添加了合成支架的组织工程材料，细胞膜片的生物相容性和生物活性更好，为递送淋巴内皮细胞修复淋巴管系统提供了一种可行的策略[42]。此外，不同流速的组织间液对淋巴内皮细胞增殖、分化及功能具有重要的调控作用，淋巴内皮细胞应对不同环境刺激而产生特定的功能分化[43]。有研究在纤维支架中设计了一种微液体流动装置，为毛细淋巴管生成提供适宜的力学刺激，模拟体内微环境中淋巴管生成机制，结果发现毛细淋巴管芽生增多[44]。因此，在组织工程毛细淋巴管的构建中，不仅需要考虑种子细胞和细胞因子，微环境中合适的机械刺激也对毛细淋巴管的生成也起到了关键作用。

5.2 组织工程化淋巴结

自体淋巴结移植已被证明是治疗淋巴水肿的有效手段，但供区淋巴结的数量有限，而且可能造成供区继发淋巴水肿。因此，探索组织工程化淋巴结是一条有价值的途径。目前，淋巴结组织工程的进展集中于模拟淋巴结的微环境以启动针对癌症的免疫应答，并治疗诸如类风湿性关节炎的免疫缺陷。Giese 等[45]使用了一个包含琼脂糖和非织造聚酰胺纤维支架、树突状细胞、外周血单核细胞的生物反应器系统，试图工程化改造出具有抗原特异性、细胞因子反应性淋巴细胞的淋巴样结构。Suematsu 等[46]试图通过将小鼠胸腺来源的基质细胞和树突状细胞嵌入由冻干法制备的不溶性牛腱胶原构成的胶原海绵中，形成了类淋巴样组织。将其植入小鼠肾包膜下区域后，能够吸引B 细胞和T 细胞，形成了具有B 细胞和T 细胞簇、高内皮小静脉样管腔、生发中心和滤泡树突细胞网络的类器官。当植入免疫缺陷小鼠时，类器官还能够诱导抗原特异性抗体产生，证实其治疗免疫缺陷疾病的功能。但其不能完全复制具有输入和输出淋巴管的天然淋巴结结构。Cuzzone 等[47]使用脱细胞小鼠淋巴结作为支架来构建组织工程化小鼠淋巴结。结果表明，脱细胞的淋巴结保留了原始组织结构，组织工程淋巴结成功地将白细胞输送到全身。这项工作显示了在制备组织工程人淋巴结时使用牛和猪来源的脱细胞淋巴结的可能性。然而，将不同的细胞类型结合到高度组织化的结构中同时保持细胞活力仍然是一个挑战。

5.3 组织工程化集合淋巴管（Tissue engineered lymphatic collecting vessels，TELCV）

尽管组织工程化毛细淋巴管在小型动物实验中表现出淋巴水肿修复的优势，但毛细淋巴管的低容量限制了其对于液体回流和稳态的控制。因此，修复集合淋巴管对于淋巴修复，尤其是严重的淋巴水肿，具有不可或缺的作用。由于自体移植淋巴管来源数目的限制，探究工程化管状支架对于淋巴内皮细胞生长的支持显得十分必要。尽管可以参照工程化血管的研究，但淋巴管系统缺乏连续基底膜覆盖，单向运输及独特的生理环境均对传统脉管工程化提出了更大的挑战[48]。Rudiger 等在1981 年首次利用聚乙醇酸硅树脂酮支架工程化改造集合淋巴管，在裸鼠模型中显著改善了淋巴内皮细胞的黏附、迁徙、生长及稳定性，显示出体外工程化改造集合淋巴管的潜力[35]。另一项研究基于POSS-PCU 促进淋巴内皮细胞增殖，并在材料表面形成2 mm 汇合层[49]。Hadamitzk 等[38]在家猪后肢淋巴水肿模型中探究了Biobridge 在淋巴管生成中的效果。实验分为Biobridge 加淋巴结，Biobridge 加VEGF-C及对照3 组培养，CT 及电阻率测定显示仅Biobridge 加淋巴结组产生了具有功能的淋巴管系统，提示VEGF-C 所诱导的淋巴管生成需要一定的方向梯度。与血管不同，淋巴液压力非常低，因此开发功能性集合管腔支架难度较血管低。相比之下，人工集合淋巴管的主要挑战是制备具有功能瓣膜的模拟结构。功能性TELCV 需要对淋巴液流动有反应，并能预防淋巴液逆向流动。TELCV 内部的LECs、平滑肌外层和双叶瓣对于促淋巴液输送，防止回流至关重要[50]，而这种功能性瓣膜尚未在组织工程化淋巴管中进行应用。

6 展望

相比血管系统，淋巴管系统的重要性经常被忽视。针对淋巴系统损伤和缺陷导致的各种疾病，目前临床的治疗方法还远无法满足需求。随着对淋巴生物学的进一步理解，已经发现了调节淋巴再生和改善功能的生长因子。对LECs 的分离和培养使我们能够在实验室制备培养系统和支架并产生人工淋巴结构。未来淋巴系统组织工程发展的关键包括建立淋巴管，促进这些淋巴管与全身结构的连接，设计功能性淋巴结构，如淋巴结，并促进淋巴系统的血管化。理想的淋巴组织工程可以通过支架和人工淋巴器官进行淋巴循环，以及完成通常由淋巴系统负责的所有功能，例如脂肪运输、免疫细胞运输和组织间液调节等。未来的挑战将是制备具有功能的淋巴器官并可以在临床进行植入，开发可以连接并整合到患者自身淋巴网络的组织工程淋巴管网。此外，血管组织工程已经取得了相当大的进展，需要将其成果整合到淋巴组织工程中，以再生功能齐全且血供良好的淋巴结构。尽管开发和植入功能性淋巴结构的目标仍然受到很多制约，但随着再生医学和组织工程技术的不断发展，制备组织工程淋巴组织变得越来越可行，可以期待在未来用于淋巴系统疾病的治疗。