微小RNA-520a-5p通过靶向调控鼠双微体基因影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

张坤虎，陈勃勃，王保江，李虎，杨帆，高良，唐宗椿

作者单位：宝鸡高新医院神经外科，陕西 宝鸡 721004

胶质瘤起源于神经间质细胞和神经实质细胞，是脑肿瘤中常见的恶性肿瘤。由于胶质瘤呈侵袭性生长，手术治疗难以根治，病人术后易复发，病死率极高［1］。目前，胶质瘤发病的病因尚不明确。微小RNA（miRNA）作为小分子单链非编码RNA在细胞增殖、凋亡和迁移等生命活动中发挥重要功能，能够作为肿瘤治疗的分子靶点［2-5］。在非小细胞肺癌、结肠癌等miR-520a-5p中表达降低，过表达miR-520a-5p可明显减弱肿瘤细胞的增殖、迁移等恶性行为［6-8］。易伟峰［9］利用MiRNA芯片技术发现胶质瘤组织中miR-520a表达下调，但miR-520a在胶质瘤细胞发生发展中的作用和分子机制还未知。本研究首先检测了胶质瘤组织中miR-520a-5p的表达水平，并以胶质瘤细胞U251为研究对象，探究了过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用及相应机制。

1 材料与方法

1.1 材料选取2016年5月至2018年11月在宝鸡高新人民医院治疗的胶质瘤病人肿瘤组织56例，其中男31例，女25例，年龄（48.39±5.81）岁，范围36~71岁。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。所有病人术前未进行放疗、化疗等治疗，经病理学检查确诊。病理分级，其中Ⅰ级胶质瘤8例，Ⅱ级26例，Ⅲ级22例。另选取56例同时期因颅脑外伤颅内减压术病人的正常脑组织作为对照，其中男38例，女18例，年龄（45.28±6.93）岁，范围34~65岁。

1.2 主要材料、试剂和仪器胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；胶质瘤U251细胞，武汉博士德生物工程有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒、RPMI 1640培养基、BCA蛋白试剂盒，英国Abcam；四氮唑蓝（MTT），上海谱振生物有限公司；Trizol试剂，美国英杰生命技术有限公司；细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、P21和鼠双微体基因（MDM2）抗体，美国Santa Cruz公司；B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体，美国Abcam公司；miR-520a-5p模拟物（mimics）、模拟对照序列（miR-NC）、miR-520a-5p抑制剂（anti-miR-520a-5p）、抑制剂对照序列（anti-miR-NC）、MDM2过表达载体（pcD⁃NA3.1-MDM2）及空载体（pcDNA3.1）、引物序列，南京金斯瑞生物科技有限公司；逆转录及PCR试剂盒，日本TAKARA公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒，艾美捷科技有限公司；双萤光素酶活性检测试剂盒，北京百奥莱博科技有限公司。PCR扩增仪，德国Eppendorf公司；NanoDrop-2000c超微量风光光度计，美国Thermo公司；酶标仪和凝胶成像系统，美国Bio-rad公司；FACSCantoⅡ流式细胞仪美国BD公司；倒置显微镜，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测miR-520a-5p表达水平 在液氮保护下充分研磨胶质瘤组织及正常脑组织。Trizol试剂提取组总RNA，逆转录后进行PCR扩增。引物序列：miR-520a-5p正向引物5'-CGTAGGATC⁃GATGCTAGCAAGT-3'，反 向 引 物5'-GCGTTGT⁃GAATGGCGTGCG-3'；U6正向引物5'-GTCAAGTC⁃GATAGCTAG-3'，反向引物5'-CGTAAATGCCTG⁃CAACG-3'。2-∆∆Ct法计算miR-520a-5p表达水平。

1.3.2 细胞培养与分组 将U251细胞培养至10%FBS的RPMI 1640培养基，当融合度达80%时，胰蛋白酶消化。细胞接种于24孔板中（2.5×105个/孔），待细胞融合至60%时，采用LipofectamineTM2000脂质体法，分别将miR-NC（miR-NC组）、miR-520a-5p mimics（miR-520a-5p组）、anti-miR-NC（anti-miR-NC组）、anti-miR-520a-5p（anti-miR-520a-5p组）、miR-520a-5p mimics与pcDNA3.1-MDM2（miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2组）、miR-520a-5pmimics与pcD⁃NA3.1（miR-520a-5p+pcDNA3.1组）转染至U251细胞，转染时间6 h。

1.3.3 MTT检测细胞增殖 各组细胞培养24 h、48 h、72 h后，加20μL浓度为5 g/L的MTT。孵育4 h弃上清，加150μL二甲基亚砜，于490 nm处上机检测吸光度（A）值。存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 培养24 h后收集各组细胞，依据凋亡检测试剂盒操作步骤检测细胞凋亡。

1.3.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭 收集各组细胞。迁移实验：向小室上室加细胞悬液100μL（2.5×104个细胞），下室加含10% FBS的培养基500 μL；培养24 h后，固定，结晶紫染色，显微镜观察并计数。侵袭实验：上室预铺Matrigel，晾干后加入细胞悬液，其余操作同迁移实验。

1.3.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达RIPA试剂提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（25μg蛋白/泳道），以cy⁃clin D1（1∶2 000）、P21（1∶1 000）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、MDM2（1∶2 000）和GAPDH（1∶1 000）为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔为二抗（1∶5 000）。以GAPDH为内参，Quantity One软件计算目的蛋白相对表达水平。

1.3.7 双萤光素酶报告基因实验 经PCR反应扩增包含miR-520a-5p结合位点的MDM2的3’UTR，插入至PGL3质粒下游，命名为WT-MDM2。利用基因突变技术将结合位点突变后，插PGL3质粒下游，命名为MUT-MDM2。向U251细胞分别共转染WTMDM2、MUT-MDM2与miR-520a-5p mimics或miRNC，转染6 h后检测萤光素酶活性。

1.4 统计学方法SPSS 22.0软件分析本研究数据。计量资料±s表示，独立样本t检验分析两组间数据，单因素方差分析分析多组间数据，总体有差异进一步采用LSD-t检验进行两两比较。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在正常脑组织和胶质瘤组织中miR-520a-5p的表达miR-520a-5p水平：正常脑组织0.75±0.07，Ⅰ级胶质瘤组织0.54±0.04，Ⅱ级胶质瘤组织0.14±0.02，Ⅲ级胶质瘤组织0.05±0.01，以上miR-520a-5p水平比较，t=64.56，P<0.001；且胶质瘤组织中miR-520a-5p表达较正常脑组织低（P<0.05）。

2.2 过表达miR-520a-5p影响U251细胞增殖、凋亡miR-520a-5p组miR-520a-5p水平、细胞凋亡率较miR-NC组高（P<0.05），细胞存活率、cyclin D1和Bcl-2水平较miR-NC组低（P<0.05），而P21和Bax水平较miR-NC组高（P<0.05）。见图1，表1。

图1 过表达miR-520a-5p对U251细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白表达的影响：A为过表达miR-520a-5p对U251细胞凋亡的影响；B为过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖和凋亡相关蛋白cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2表达的影响

表1 过表达miR-520a-5p对细胞U251增殖、凋亡的影响/±s

表1 过表达miR-520a-5p对细胞U251增殖、凋亡的影响/±s

注：miR-520a-5p为miR-520a-5p模拟物，cyclin D1为细胞周期蛋白D1，P21为P21蛋白，Bax为B淋巴细胞瘤-2相关蛋白，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

组别miR-NC miR-520a-5p t值P值重复次数33 miR-520a-5p 0.14±0.01 0.58±0.06 17.72<0.001 cyclin D1蛋白0.72±0.07 0.16±0.02 18.84<0.001 P21蛋白0.25±0.02 0.90±0.09 17.27<0.001 Bax蛋白0.28±0.03 0.81±0.08 15.20<0.001 Bcl-2蛋白1.06±0.10 0.32±0.03 17.36<0.001凋亡率/%7.82±0.77 21.17±2.06 14.87<0.001细胞活性（OD 490 nm）24 h 0.50±0.05 0.46±0.04 5.36<0.001 48 h 0.95±0.09 0.49±0.05 10.94<0.001 72 h 1.36±0.13 0.71±0.07 10.78<0.001

2.3 过表达miR-520a-5p对U251细胞迁移、侵袭的影响miR-520a-5p组迁移和侵袭细胞数较miRNC组低（P<0.05），MMP-2的水平较miR-NC组低（P<0.05），而E-cadherin水平较miR-NC组高（P<0.05）。见图2，3；表2。

表2 过表达miR-520a-5p对细胞U251迁移、侵袭及相关蛋白的影响/±s

表2 过表达miR-520a-5p对细胞U251迁移、侵袭及相关蛋白的影响/±s

注：E-cadherin为E-钙黏蛋白，MMP-2为基质金属蛋白酶2。

组别miR-NC miR-520a-5p t值P值重复次数33 E-cad⁃herin 0.12±0.01 0.58±0.05 22.10<0.001 MMP-2 0.91±0.09 0.35±0.03 14.46<0.001迁移细胞数144±13.38 67±6.26 12.77<0.001侵袭细胞数135±13.12 59±5.47 13.10<0.001

图2 脑胶质瘤组织中过表达miR-520a-5p对U251细胞迁移、侵袭数的影响（结晶紫染色×200）

2.4 miR-520a-5p靶向调控MDM2的表达MDM2的3’UTR与miR-520a-5p的互补序 列 见 图4A。miR-520a-5p mimics与WT-MDM2共转染至U251细胞后，萤光素酶活性明显降低（P<0.05），而miR-520a-5p mimics与MUT-MDM2共转染至U251细胞后，萤光素酶活性无显著变化（P>0.05），见表3。

表3 双萤光素酶报告实验结果/±s

表3 双萤光素酶报告实验结果/±s

注：WT-MDM2为野生型MDM2基因，MUT-MDM2为突变型MDM2基因。

组别miR-NC miR-520a-5p t值P值重复次数33 WT-MDM2 1.01±0.09 0.20±0.02 21.52<0.001 MUT-MDM2 0.99±0.09 0.94±0.09 0.97 0.359

miR-NC组、miR-520a-5p组、anti-miR-NC组、an⁃ti-miR-520a-5p组MDM2的蛋白水平分别为0.50±0.05、0.12±0.01、0.51±0.05、0.92±0.09。与miR-NC组比较，miR-520a-5p组MDM2的蛋白水平显著降低（P<0.05）；而与anti-miR-NC组比较，anti-miR-520a-5p组MDM2的蛋白水平显著升高（P<0.05），见图4B。这表明miR-520a-5p靶向负调控MDM2表达。

图4 miR-520a-5p靶向调控MDM2表达：A为MDM2的3’UTR与miR-520a-5p互补的核苷酸序列；B为miR-520a-5p对MDM2蛋白表达的影响

2.5 过表达MDM2降低了miR-520a-5p对U251细胞增殖、凋亡作用miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2组存活率、cyclin D1和Bcl-2水平较miR-520a-5p+pcDNA3.1组高（P<0.05），凋亡率、P21和Bax水平较miR-520a-5p+pcDNA3.1组低（P<0.05）。见图5，表4。

表4 过表达MDM2逆转miR-520a-5p对细胞U251增殖和凋亡的作用/±s

表4 过表达MDM2逆转miR-520a-5p对细胞U251增殖和凋亡的作用/±s

注：MDM2为鼠双微体基因，Bax为B淋巴细胞瘤-2相关蛋白，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，cyclin D1为细胞周期蛋白D1，P21为P21蛋白。①与miR-NC组比较，P<0.05。②与miR-520a-5p+pcDNA3.1组比较，P<0.05。

组别miR-NC miR-520a-5p miR-520a-5p+pcDNA3.1 miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2 F值P值重复次数3 3 3 3 MDM2蛋白0.50±0.05 0.11±0.01①0.11±0.01 0.34±0.03②242.00<0.001 Bax蛋白0.28±0.03 0.81±0.08①0.80±0.08 0.53±0.05②94.47<0.001 Bcl-2蛋白1.06±0.10 0.32±0.03①0.31±0.03 0.68±0.07②182.17<0.001凋亡率/%7.82±0.77 21.17±2.06①21.15±2.06 12.36±1.21②100.80<0.001 CyclinD1蛋白0.72±0.07 0.16±0.02①0.15±0.02 0.41±0.04②236.93<0.001 P21蛋白0.25±0.02 0.90±0.09①0.90±0.09 0.53±0.05②125.36<0.001细胞活性（OD 490 nm）24 h 0.50±0.05 0.46±0.04①0.34±0.03 0.45±0.04②20.70<0.001 48 h 0.95±0.09 0.49±0.05①0.47±0.05 0.68±0.07②66.17<0.001 72 h 1.36±0.13 0.71±0.07①0.70±0.07 0.96±0.09②66.00<0.001

图5 过表达MDM2降低了miR-520a-5p对U251增殖凋亡相关蛋白表达的影响：A为同时过表达miR-520a-5p和MDM2对U251细胞凋亡的影响；B为同时过表达miR-520a-5p和MDM2对U251细胞中cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

2.6 过表达MDM2降低了miR-520a-5p对U251细胞迁移、侵袭的作用miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2组迁移和侵袭细胞数、MMP-2水平较miR-520a-5p+pcDNA3.1组高（P<0.05），E-cadherin水平较miR-520a-5p+pcDNA3.1组低（P<0.05）。见图6，7；表5。

表5 过表达MDM2逆转miR-520a-5p对细胞U251迁移、侵袭及相关蛋白表达的作用/±s

表5 过表达MDM2逆转miR-520a-5p对细胞U251迁移、侵袭及相关蛋白表达的作用/±s

注：E-cadherin为E-钙黏蛋白，MMP-2为基质金属蛋白酶2，MDM2为鼠双微体基因。①与miR-NC组比较，P<0.05。②与miR-520a-5p+pcDNA3.1组比较，P<0.05。

组别miR-NC miR-520a-5p miR-520a-5p+pcDNA3.1 miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2 F值P值重复次数3333 E-cadherin 0.12±0.01 0.58±0.05①0.59±0.06 0.30±0.03②176.76<0.001 MMP-2 0.91±0.09 0.35±0.03①0.32±0.03 0.62±0.06②134.76<0.001迁移细胞数144±13.38 67±6.26①65±6.10 102±9.55②95.39<0.001侵袭细胞数135±13.12 59±5.47①57±5.41 95±9.26②102.21<0.001

图3 过表达miR-520a-5p对U251细胞中MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

图6 脑胶质瘤组织中过表达miR-520a-5p及MDM2对U251细胞迁移和侵袭数的影响（结晶紫染色×200）

3 讨论

miRNA通过调控靶基因的表达及相关信号通路，发挥类似抑癌基因或癌基因的作用，参与肿瘤的发生、发展及转归过程［10-11］。作为一种miRNA，miR-520a-3p与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究显示，过表达miR-520a-3p可减弱非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时还可促进细胞凋亡，其通过靶向负调控EphA2表达抑制NSCLC发展进程［12］；miR-520a-3p在胃癌组织和细胞中miR-520a-3p表达下调，过表达miR-520a-3p通过靶向抑制SKA2的表达显著减弱了胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的增殖、侵袭和迁移能力，可能是胃癌治疗的新靶点［13］；甲状腺乳头状癌（PTC）组织中miR-520a-3p表达下调，促进miR-520a-3p表达通过靶向抑制JAK1下调PTC细胞活力、迁移和侵袭能力，同时促进细胞凋亡，阻滞细胞周期进程［14］。但目前，miR-520a-5p在胶质瘤发生发展中的作用和分子机制还未知。

本研究首先检测了胶质瘤组织和正常脑组织中miR-520a-5p表达水平，结果显示，在胶质瘤组织中的表达miR-520a-5p明显降低，提示miR-520a-5p可能作为抑癌癌基因参与胶质瘤发生和发展。通过转染miR-520a-5p mimics过表达胶质瘤U251细胞中miR-520a-5p后，细胞OD值、迁移和侵袭数降低，增加凋亡率升高，过表达miR-520a-5p抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，且促进细胞凋亡。cyclin D1是调控细胞周期的重要蛋白，上调cyclin D1表达可促进细胞从G1期进入S期，促进细胞增殖［15］。P21是细胞增殖抑制因子，上调P21表达能够显著抑制细胞增殖［16］。Bax、Bcl-2参与细胞凋亡，而Bcl-2表达增加时则与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡作用［17］。MMP-2作为一种基质金属蛋白酶，可通过降解细胞外基质发挥促进肿细胞迁移和侵袭的功能［18］。肿瘤细胞经上皮间质转化过程失去极性而获得间质特性促进自身迁移，而其E-cad⁃herin作为上皮标志物表达降低［19］。本研究显示，过表达miR-520a-5p后可抑制cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白表达，增加P21、E-cadherin和Bax蛋白表达，发挥抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡的功能，提示miR-520a-5p可作为胶质瘤治疗的分子靶点。

MDM2位于人染色体12q13-14，参与多发性骨髓瘤、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生和发展［20-22］。研究显示，MDM2蛋白在胶质瘤组织中表达升高，与胶质瘤的病理分级等临床特征密切相关，可用于胶质瘤病人预后评估的参考指标［23］；敲减circSERPINA3可靶向miR-944/MDM2抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭［24］；miRNA-379-5p通过直接靶向MDM2抑制膀胱癌细胞的生长和迁移［25］；miR-548b-3p可靶向抑制MDM2表达降低乳腺癌细胞的增殖和转移［26］。为了探讨miR-520a-5p影响胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用机制，本研究通过证实miR-520a-5p负调控MDM2表达，过表达MDM2降低过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、迁移和迁徙能力的抑制作用及细胞凋亡的促进作用，表明过表达miR-520a-5p通过靶向负调控MDM2抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡。

图7 过表达miR-520a-5p及MDM2对U251细胞中MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

综上所述，miR-520a-5p可能通过靶向负调控MDM2表达抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，并诱导其凋亡。