温阳生肌凝胶中挥发油提取与包合工艺研究

胡青，黄莉，唐林，陈丽，戴冰，肖望重

作者单位：1湖南中医药大学第一附属医院药学部，湖南 长沙 410007；2湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410001

温阳生肌凝胶为湖南中医药大学第一附属医院烧伤疮疡整形科的临床经验方，由肉桂、丁香、乳香、没药组成，具有温阳行气，去腐生肌功效，临床上常用于治疗各种慢性皮肤溃疡［1-2］。现代药理研究表明该四味药中的挥发油具有抗菌消炎、抗溃疡与促进创面修复等作用［3-6］，故挥发油为该制剂的主要有效成分之一。然而，挥发油物理性质不稳定，容易挥发，给生产与储存带来诸多不便，因此，为提高挥发油在凝胶中的稳定性，确保温阳生肌凝胶临床疗效，2021年3—6月，本研究以君药肉桂中挥发性成分桂皮醛为指标成分，建立了桂皮醛的含量测定方法，并采用正交试验法对该制剂的挥发油提取与β-环糊精包合工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药1260 InfinityⅡ型HPLC仪，包括二极管阵列检测器、LC1260色谱工作站（美国Agi⁃lent公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；AUW220D型万分之一电子分析天平（上海海鸿仪器有限公司）；SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

桂皮醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号110710~201821）；β-环糊精（上海源叶生物科技有限公司，批号Z30M10Y89545），乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。肉桂（批号20061331D）由江苏龙凤堂中药有限公司提供；丁香与乳香由湖南新汇制药股份有限公司提供；没药由湖南衡岳中药饮片有限公司提供，经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授鉴定，肉桂为樟科植物肉桂的干燥树皮、丁香为桃金娘科植物丁香的干燥花蕾、乳香为橄榄科植物乳香树及同属植物树皮渗出的树脂、没药为橄榄科植物地丁树.或哈地丁树的干燥树脂。

1.2 方法

1.2.1 桂皮醛含量测定

1.2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相∶乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

1.2.1.2 对照品溶液制备 采用减量称重法，精密称取桂皮醛对照品28.4 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为1.136 0 g/L的对照品溶液

1.2.1.3 供试品溶液制备 根据处方要求，称取肉桂、丁香、乳香、没药适量，按《中国药典》2020版四部挥发油测定法（甲法）提取5 h，收集挥发油。量取挥发油3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，滤过，取续滤液，既得。

1.2.1.4 阴性样品溶液制备 根据处方要求，称取缺肉桂的其他样品各适量，按“1.2.1.3”项方法制备阴性样品溶液。

1.2.1.5 空白对照溶液 以甲醇为空白对照溶液。

1.2.2 系统适用性试验 取上述空白对照溶液、对照品溶液、供试品溶液以及阴性样品溶液各适量，按“1.2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，可见桂皮醛色谱峰分离度为3.64，理论塔板数为7 296，且与其他成分峰基线分离，空白对照溶液与阴性样品溶液对测定无干扰，色谱图结果见图1。

图1 桂皮醛含量测定系统适用性试验高效液相色谱图：A为空白溶剂；B为对照品；C为样品；D为阴性样品

1.3 统计学方法数据分析使用SPSS 25.0进行处理，实验数据用±s表示，采用多因素方差分析和独立样本t检验进行差异比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性关系考察取“1.2.1.2”项下对照品溶液1μL、2μL、4μL、8μL、10μL，按照“1.2.1.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品进样质量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果回归方程为Y=392.57X-376.67（r=0.999 5），桂皮醛检测进样量线性范围为1.136~11.36μg。

2.2 试验及含量测定

2.2.1 精密度试验 取“1.2.1.2”项下对照品溶液适量［7-8］，按“1.2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果桂皮醛峰面积RSD为1.36%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取上述四味药材适量，共6份，分别按“1.2.1.1”项与“1.2.1.3”项下方法试验，结果桂皮醛平均含量为6.67 mg/g，RSD为1.17%。

2.2.3 稳定性试验 取“1.2.1.3”项下的同一份供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果桂皮醛峰面积RSD为1.46%（n=6），表明供试品溶液置于室温中24 h内稳定。

2.2.4 加样回收试验 精密称取上述四味药材，分别精密加入桂皮醛对照品6.816 0 mg，按“1.2.1.3”项制备供试品溶液，按“1.2.1.1”项下色谱条件进样测定，平均回收率为99.58%，RSD值为1.31%，表明该法准确性良好，结果见表1。

表1 桂皮醛加样回收率试验结果（n=6）

2.2.5 含量测定 取上述四味药材各适量，共9份，分别按“1.2.1.1”项与“1.2.1.3”项下方法试验，结果，桂皮醛含量范围为3.251 7~7.175 6 mg/g。

2.3 挥发油提取工艺研究

2.3.1 正交实验设计 结合相关文献报道与预试验结果［9-11］，选择药材浸泡时间、加水量、提取时间为考察因素，每个因素设置3个水平，以桂皮醛含量与挥发油得率为考察指标（综合评分中桂皮醛含量与挥发油得率的权重系数分别为0.7、0.3，即综合评分=桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×70%×100+挥发油得率/最大挥发油得率×30%×100），选用L9（34）正交表进行试验。其中因素水平见表2，试验设计与结果见表3，方差分析见表4。

表2 肉桂挥发油提取工艺研究因素水平

表3 肉桂挥发油提取工艺试验设计与结果

表4 肉桂挥发油提取工艺方差分析

2.3.2 结果分析 由正交试验与方差分析结果可知，所选因素中对挥发油提取的影响程度大小分别是C>B>A，即提取时间>加水量>浸泡时间，其中因素C对提取工艺有显著性影响（P<0.05），因素A、B无显著性影响，结合实际生产情况与成本控制，认定最优挥发油提取工艺为A1B1C3，即加8倍量水，浸泡30 min，提取8 h。

2.4 挥发油包合工艺研究

2.4.1 包合物制备方法选择 目前挥发油包合常用方法为饱和水溶液法与研磨法［12-14］，因此以挥发油包合率与收得率为考察指标，分别对饱和水溶液法与研磨法进行考察，其中空白包合率（%）=回收挥发油量（mL）/加入挥发油量（mL）×100%，包合率（%）=包合物含油量（mL）/［包合物加油量（mL）×空白回收率（%）］×100%；收得率（%）=包合物重量（g）/［β-环糊精重量（g）+挥发油重量（g）］×100%。结果研磨法与饱和水溶液法包合率分别为（67.61±0.95）%、（51.63±1.35）%，t=13.68，P<0.001；研磨法与饱和水溶液法收得率分别为（79.40±0.73）%、（63.25±2.61）%，t=8.42，P=0.001，表明研磨法的包合率与收得率均高于饱和水溶液法，且均P<0.05，故选择研磨法包合挥发油。

2.4.2 正交实验设计 结合相关文献报道与预试验结果［15-16］，选择β-环糊精投料比、加水量、研磨时间为考察因素，每个因素设置3个水平，以包合率与收得率为考察指标（综合评分中包合率与收得率的权重系数均为0.5，即综合评分=包合率/最大包合率×50%×100+收得率/最大收得率×50%×100），选用L9（34）正交表进行试验。其中因素水平见表5，试验设计与结果见表6，方差分析见表7。

表5 肉桂挥发油包合工艺因素水平

表6 肉桂挥发油包合工艺试验设计与结果

表7 肉桂挥发油包合工艺方差分析

2.4.3 结果分析 由正交试验与方差分析结果可知，所选因素中挥发油投料比（A）、加水量（B）、研磨时间（C）对包合效果均有显著性影响，且影响程度大小分别是C>B>A，因此确定最优挥发油包合工艺为A3B2C3，即挥发油与β-环糊精比例为1∶10（mL∶g），加水量为5倍，研磨3 h。

2.4.4 验证试验 依照挥发油最优提取条件（A1B1C3）与最优包合条件（A3B2C3）进行平行试验3次，结果见表8。

表8 肉桂挥发油提取与包合验证试验

2.5 挥发油包合物TLC鉴别取混合挥发油0.2 mL，加乙醇定容至1 mL量瓶中，为供试品溶液1；取包合物粉末1 g，共2份，一份加乙醇10 mL超声提取30 min，静置，滤过，取续滤液为供试品溶液2，另一份加乙醇10 mL振摇30 min，滤过，取续滤液为供试品溶液3；取β-环糊精粉末1 g，加乙醇10 mL振摇10 min，静置，滤过，取续滤液为供试品溶液4；吸取上述供试品溶液各2μL，分别点样于硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）∶乙酸乙酯（9∶1）饱和15 min后展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，置105℃烘烤箱中加热至斑点清晰，结果样品1、2在相同位置显示相同颜色的斑点，而样品3、4未见任何斑点，表明包合物表面未残留挥发油，且混合挥发油经β-环糊精包前后化学性质未发生明显变化。

3 讨论

温阳生肌凝胶是在该院烧伤疮疡整形科主任周忠志教授所创的温阳生肌方基础上进行剂型改进而成，处方中各类药物挥发油为该方的主要药效部位之一，在药物制备中应予以保留。目前部分挥发油的提取工艺优化考察指标为挥发油得率或挥发油含量［17-18］，该法存在考察指标单一，挥发性主要成分含量不可控等缺点，而本实验采用双指标综合加权评价开展正交试验研究，以君药肉桂中挥发性成分桂皮醛为指标成分，建立了桂皮醛的含量测定方法，并结合挥发油得率对挥发油提取工艺进行优化，这样既保障了挥发油得率，又对挥发性成分含量指标进行有效控制，比单一考察挥发油得率更加科学合理。

经文献查询，制剂过程中部分挥发油直接喷洒在药材颗粒或粉末上，这样既容易导致挥发油挥发，降低疗效，也容易增加制剂的油性异味，且质量不可控［19-20］，因此本研究采用具有环状中空圆筒结构且可被人体吸收的β-环糊精对挥发油进行包合，即可增加挥发油的稳定性和溶解度，又能提高药物生物利用度，且该工艺操作简便，稳定可行，适用于工业生产。β-环糊精包合挥发油的鉴别方法较多，本试验采用常用的薄层色谱法进行验证，结果提示挥发油包合后性质较稳定。

综上所述，本研究优化所得的挥发油提取与包合工艺操作简便，稳定可行，且重现性良好，该结果可为温阳生肌凝胶后续研究开发与实际生产提供技术参考与理论依据。