肿瘤细胞周期相关蛋白在肾移植术后弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系

张琼果，徐璐，李莉，庄乙君，张秋

作者单位：1海南医学院第一附属医院，a血液净化中心，b血液内科，海南 海口 570100；2海南医学院第二附属医院血液净化中心，海南 海口 570100；3海南省肿瘤医院肿瘤内科，海南 海口 570100

肾移植是终末期肾病病人延续生命的重要手段，然而临床观察仍有较多因素可影响肾移植病人的长期生存［1］。研究表明，进行移植手术的病人肿瘤发病率高于一般人群，主要以皮肤、淋巴组织增生性肿瘤为主，弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最为常见的类型，也是影响病人预后的重要因素［2］。目前肾移植术后发生DLBCL的机制尚未明确，可能与免疫抑制剂导致EB病毒感染及淋巴细胞增殖失调有关［3］。肿瘤细胞周期相关蛋白（CREPT）是2012年常志杰教授鉴定的人类基因，并证实该基因在胃癌、直肠癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均存在表达增高，且其水平与病人预后存在密切关系［4-6］。目前CREPT在肾移植术后DLBCL发生、发展中的作用关系仍较少有研究报道，其表达是否与其发生存在某种关系仍有待临床探讨。本研究肾移植术后发生DLBCL的病人作为研究对象，分析预后与CREPT的关系，旨在为明确DLBCL的发生、发展机制研究提供思路，为早期评估病人病情、预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年2月至2019年8月海南医学院第一附属医院、海南省肿瘤医院、海南医学院第二附属医院收治的肾移植术后发生DLBCL的病人作为研究对象，纳入病例组，以病灶组织作为研究样本；病例组纳入标准：进行肾移植手术治疗，移植手术资料完整；符合《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断及治疗指南》［7］相关标准；在院进行DLBCL治疗，治疗资料及随访资料完整。排除标准：临床资料不全者；合并其他肿瘤者；无随访数据者。医院收治肾移植病人共2 104例，其中40例发生DLB⁃CL，40例全部纳入病例组，另外选择50例增生性淋巴结炎组织作为对照组。所有病人或其近亲属均签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 一般资料：性别、年龄、体质量指数。肾移植相关资料：肾移植年限、EB病毒感染情况、移植肾功能情况。DLBCL相关情况：发病位置、B症状（不明原因发热、盗汗、半年体质量下降10%以上）情况、Ann Arboe分期、生发中心表型、乳酸脱氢酶（LDH）水平、体能评分（ECOG）［8］等。

1.2.2 CREPT表达情况 采用免疫组化方法检测CREPT的表达，石蜡包被组织，切片机制备石蜡切片，切片厚度为4μm，依次浸入二甲苯、降梯度乙醇溶液脱蜡、复水，切片置入过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，清水冲洗后加入胎牛血清封闭10 min。加入一抗（鼠抗人CREPT单克隆抗体，稀释倍数为1∶500，购自美国EPITOMICS公司），湿盒内孵育过夜；室温放置10 min后洗涤，加入二抗工作液（生物素标记的羊抗兔二抗工作液），37℃孵育30 min，洗涤，加链霉卵白素工作液，DAB显色5 min，观察显色满意后自来水冲洗，苏木精复染，盐酸分化，再进行脱水、透明、封片。采用日本奥林匹斯显微镜观察切片，每张切片选择5个高倍镜视野，CREPT细胞定位为细胞核或细胞质，按照染色强度及染色细胞百分比进行评价，其中不着色记为0分，浅棕黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；阳性细胞所占比例<25%记为1分，25%~<50%记为2分，50%~75%记为3分，>75%记为4分，染色强度与阳性细胞百分比评分乘积为染色总积分，总分0~3分为低表达，>3~12分为高表达。

1.2.3 治疗及预后 参考《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断及治疗指南》［7］进行治疗，按照NCCN淋巴瘤临床实践指南［9］评估治疗效果，治疗效果分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定、疾病进展，其中完全缓解及部分缓解视为治疗有效；进行随访，收集病人总生存期（OS）、无进展生存期（PFS），以病理确诊当日作为随访起点，随访截止时间为2021年4月，随访以门诊复诊、电话随访为主，其中OS为病理确诊日至任何原因导致死亡的时间；PFS为病理确诊日至开始出现肿瘤进展或死亡的时间。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0进行数据处理与统计学分析。计数资料以频数及率表示，组间比较行χ2检验或Fisher确切概率法，符合正态分布的资料以±s表示，两组间比较行独立样本t检验，采用logistic多因素分析治疗效果的影响因素，采用Ka⁃plan-Meier法及log-rank检验进行生存时间及生存率的分析，采用Cox比例风险回归模型分析病人预后相关影响因素。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾移植术后DLBCL病人CREPT表达情况CREPT定位于细胞核或细胞质，40例肾移植术后发生DLBCL病人中，CREPT低表达者17例，高表达者23例；50例增生性淋巴结炎组织中，CREPT低表达者45例，高表达者5例，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。详见图1。

图1 肾移植术后弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）病人肿瘤细胞周期相关蛋白（CREPT）表达情况（苏木精-伊红染色×200）：1A为DLBCL病人CREPT强阳性表达；1B为增生性淋巴结炎组织CREPT

2.2 肾移植术后DLBCL病人CREPT表达与临床参数的相关性低表达组及高表达组病人性别、年龄、体质量指数、肾移植年限、移植肾功能、B症状情况、ECOG分级、LDH、生发中心表型等资料比较差异无统计学意义（P>0.05）；高表达组EB活化率高于低表达组，高Ann Arboe分期病人比例高于低表达组（P<0.05）。详见表1。

表1 肾移植术后DLBCL病人40例CREPT表达与临床参数的相关性

2.3 DLBCL病人治疗情况分析所有病人均进行4~6个疗程的利妥昔单抗联合化疗治疗，治疗结束后评估疗效，其中达到有效标准病人36例，无效者4例。多因素分析示，Ann Arboe分期是治疗效果的影响因素（P<0.05）。详见表2。

表2 DLBCL病人40例治疗效果的影响因素分析

2.4 CREPT表达与DLBCL病人预后的关系分析截至2021年4月，病人随访总时间为10~96个月，中位随访时间为41个月，两组PFS比较差异无统计学意义（log-rankχ2=2.25，P=0.133）；CREPT高表达组病人OS显著低于低表达组（log-rankχ2=3.89，P=0.049）。详见图2，3。

图2 肿瘤细胞周期相关蛋白（CREPT）高表达及低表达病人无进展生存期（PFS）的生存曲线

图3 肿瘤细胞周期相关蛋白（CREPT）高表达及低表达病人总生存期（OS）的生存曲线

2.5 DLBCL病人预后的影响因素分析以病人OS、PFS作为因变量，以一般资料、肾移植相关资料、DLBCL资料、治疗情况等资料作为自变量进行Cox多因素分析，Ann Arboe分期、治疗应答情况与PFS回归相关（P<0.05）；移植肾功能降低、Ann Arboe分期、ECOG评分、治疗应答情况、CREPT表达情况与OS相关（P<0.05）。详见表3，4。

表3 肾移植术后发生DLBCL病人40例PFS的影响因素分析

3 讨论

肾移植术后DLBCL的发生对病人生存时间有较大影响，分析其发生的可能机制、寻找潜在的标志物对于临床诊治有一定临床意义。CREPT是近年来发现的一种新的癌基因，目前认为其可通过调节细胞周期影响恶性肿瘤的发生及发展［10］。本研究结果显示，与增殖性淋巴结相比，DLBCL病人CREPT高表达率较高，可能与DLBCL的发生相关。目前已有较多研究探讨了CREPT基因表达与恶性肿瘤的关系，但与DLBCL之间的关系仍较少有研究报道。结合DLBCL发生机制分析两者之间的关系，DLBCL以活跃的细胞增殖为主要特征，而CREPT是公认的调节细胞周期进程及细胞凋亡的基因，其表达增强可能与肿瘤的发生相关［11-12］。目前关于肾移植术后DLBCL发生的原因及机制尚未阐释清楚，可能与肾移植术后免疫抑制导致淋巴细胞激活异常、BK感染相关［13-14］。本研究中对比了CREPT高病人及低病人的临床资料，发现高表达组EB活化率高于低表达组，高Ann Arboe分期病人比例高于低表达组，推测CREPT高表达可能与EB活化状态有一定关系，而其表达情况与病人的临床特征存在一定联系，但基因表达与EB活化的关系目前无研究报道，两者之间的具体作用关系仍有后续研究探讨。

表4 肾移植术后发生DLBCL病人40例OS的影响因素分析

DLBCL病人预后较差，对于本身存在免疫力低下的肾移植病人，其预后受到的影响更多。本研究结果显示，肾移植术后DLBCL病人PFS的影响因素主要为临床分期及治疗反应性情况，这一结果与既往报道的DLBCL病人预后的相关因素类似［15-17］。随着临床分期的加深，病人肿瘤大小、病灶数量增加，治疗难度较大，预后相对较差；治疗效果主要是评估治疗方式下短期疗效，但研究表明，近期疗效显著的病人体内肿瘤清除较为干净，术后复发概率较小，有利于提高病人的无进展生存期［18］。肾移植术后DLBCL病人OS的影响因素主要有临床分期、移植肾功能情况、ECOG评分、治疗应答情况、CREPT表达情况等。肾移植手术病人术后需长期服用抗排异反应药物，机体处于免疫抑制状态，其远期的长期生存除与DLBCL病情有关，也与肾功能、身体状态有关，存在移植肾功能降低的病人远期生存较差，ECOG评分较差的病人身体质量较差，对于化疗、治疗的耐受性也较差，同样影响远期生存［19］。CREPT与DLBCL病人OS存在一定关系的原因可能为一方面，表达情况与病人的临床特征存在一定关系，CREPT高表达病人临床分期较高，这部分病人治疗效果较差；另外，如上文所述，CREPT表达与BK感染存在一定关系，而后者是引起BK相关肾病从而引起肾功能丢失的重要原因［20］，在本研究中CREPT高表达病人BK感染率较高，远期预后较差。既往较少有研究探讨CREPT与DLBCL病人预后的关系，刘军等［21］研究证实CREPT在肾癌组织中高表达，且病人总体生存时间及无瘤生存时间均与之相关；Wen等［22］针对宫颈癌病人的研究也证实，CREPT与宫颈癌预后密切相关，本研究在前人研究结果基础上进一步证实这一点。当前抗肿瘤药物研发成为临床研究的重点及难点，CREPT作为一种与肿瘤发生及发展密切相关的蛋白，通过调控其表达或可抑制肿瘤的进展，目前已有降解CREPT多肽抑制剂在胰腺癌细胞中的应用研究，未来可能成为肿瘤新药研发的方向。

综上所述，肾移植术后DLBCL病人CREPT表达率较高，且与病人临床特征、预后存在一定关系，或可为肿瘤机制研究、肿瘤新药的研究提供新思路。本研究局限性在于本研究纳入对象为肾移植术后DLBCL的病人，临床病例较少；另外CREPT与DLBCL临床特征的相互作用关系仅为推断，具体作用机制仍有待后续研究探讨。