肺炎支原体的实验室检测技术研究进展

周立中

滨州市人民医院 山东 滨州 256610

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，Mp)是一种介于细菌与病毒之间﹑在有氧或无氧环境中均能独立存活的最小病原微生物，主要通过呼吸道飞沫或气溶胶传播，是引起社区获得性肺炎的重要病原体之一[1]。Mp感染早期临床症状与其他细菌和病毒感染肺炎无明显区别，多见剧烈咳嗽﹑发热(常为稽留热)﹑畏寒﹑头痛和咽痛[2-3]，且对作用一般细菌细胞壁的抗生素，如青霉素﹑头孢菌素等不敏感，必须需选用抑制蛋白质合成的大环内酯类﹑氟喹诺酮类﹑四环素类抗生素进行治疗。因此，Mp的早期实验室检测对合理选用抗生素治疗具有重要意义。目前Mp实验室检测方法主要有分离培养﹑抗原检测﹑抗体检测和基因诊断技术检测等。

1 分离培养

Mp分离培养作为传统的检测手段，是判断Mp感染的“金标准”。Mp分离培养常以牛心消化液为基础另加20小牛血清及新鲜酵母浸液制成液体或固体培养基，初次分离需要孵育7～15d，待培养基指示剂由粉红色变黄色后，及时转种于固体平板培养基，5%CO2环境中培养1～2周可长出菌落直径小于0.5mm的荷包蛋样菌落，以此可初步诊断，再进一步进行生化反应和血清学鉴定。Kashyap等[4]认为采用咽拭子或痰液标本进行Mp分离培养是目前检测Mp感染的可靠方法之一，但是Mp分离培养对培养环境要求较苛刻，耗时长，一般培养分离阳性率不高，难以作为临床常规项目开展。近年来，Puppe等[5]研发出快速检测Mp的培养基，它是利用Mp生长代谢产物让培养基液体中指示剂从红色变成澄黄色来判断Mp生长，快速培养法直接检测Mp病原体，且培养基中富含高营养和快速生长因子，标本中含有微量的病原体就可迅速增殖，大大缩短了培养时间。还有研究报道，该方法检测Mp的假阳性率较高，但容易被细菌和真菌污染而造成假阳性，故该方法特异性还有待进一步提高，因此有必要在培养48h作第一次判定结果后转种进一步做一般细菌培养。

2 抗原检测

Mp抗原检测方法包括对流免疫电泳(counter immunoelectro-phoresis)﹑免疫印迹(immunoblot-ting)和抗原捕获EIA(antigen capture enzym eimmunoas-say)，这些方法操作耗时费力，敏感性较低，并且检测过程中需Mp特异性抗体，不适于临床检测。Miyashita N等[6]以不同菌株Mp单克隆抗体作为包被物，采用双抗体夹心ELISA检测Mp抗原，同时以PCR法作平行测定，结果显示两种方法无显著性差异。该方法具有快速﹑简便﹑灵敏度高﹑特异性强等诸多优点，并且和其它支原体没有交叉反应，但同时亦需要特异性好﹑效价高的Mp单克隆抗体，所以未能广泛普及，目前市场还尚无商品化的Mp抗原检测试剂盒。

3 血清学检测

Mp感染机体后，经过免疫反应体内可产生特异性的IgM﹑IgG类抗体，其中IgM抗体在感染1周后可检测出阳性，3～4周后达高峰，能作为早期感染的诊断指标。IgG抗体出现较迟，其浓度峰在Mp感染后的第5周，一般提示有既往感染，单独检测意义不大。Mp血清学检测主要包括非特异性抗体试验和特异性抗体试验[7]。

3.1 非特异性抗体试验

Mp感染机体后，血清中除出现特异性抗体外，还存在刺激机体产生的非特异性冷凝集素。该凝集素能与O型Rh阴性红细胞在4℃条件发生凝集反应，血清滴度≥1：64，判为阳性，效价越高或者双份血清效价呈4倍以上，提示近期Mp感染的可能性较大[8]。非特异凝集试验操作简单，但其特异性相对较低，除Mp感染患者外，如流感病毒﹑立克次体和腺病毒等感染也会产生冷凝集素，造成假阳性，因此该方法只可作为辅助诊断Mp感染的方法。

3.2 特异性抗体试验

Mp 特异性抗体试验包括补体结合试验 (Complement fixation test，CFT)﹑颗粒凝集试验 (particle agglutination test，PAT ／ PA)﹑间接血凝试验 (indirect hemagglutination test，IHT)﹑问接免疫荧光试验 (Immuno-fluorescence test，IFT)和酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assays，ELISA)。

3.2.1 CFT试验

CFT试验是最早应用于Mp实验室常规诊断的试验方法。Mp的抗原糖脂成分可刺激机体产生特异性抗体，与Mp抗体结合后形成固有补体使之不发生溶血反应。该方法以Mp糖脂类抗原为标记物，检测血清中是否存在Mp抗体，其中抗体效价呈倍增长，或单份血清效价≥1：64～1：128者有诊断价值，通常用双份血清试验可判定Mp感染是否处于急性期或恢复期。刘方鹤等[9]报道CFT试验反应稳定，敏感性和特异性均好，但较为烦琐，且以检测IgM抗体为主，不能检测IgG等抗体，初次感染时出现阳性率高，再感染者容易出现假阴性，并且在老年体弱患者中，因此，即使CFT试验呈阴性也不可以排除Mp感染，故临床应用较少。

3.2.2 PA试验

PA试验是采用致敏粒子与试验血清进行孵育发生凝集的血清学试验。双份血清(间隔2周)抗体滴度呈4倍或4倍以上上升或降低或抗体滴度持续>1：160时，均可确诊为Mp感染，这是目前国际公认的标准。我国学者靳冰等[10]研究结果显示PA试验灵敏度为96.4%，特异性为100%，以及准确度为97.9%，说明PA试验特异性强，操作简便，适用于临床快速诊断，但该方法采用的Mp进口试剂价格昂贵，窗口期不能被检测，易造成漏检。

3.2.3 IHT试验

IHT试验主要用于检测IgM抗体，在微量凝血板上被检血清与血清对照，其余各孔加致敏红细胞后震荡混匀，红细胞凝集程度在“++”﹑血凝抗体滴度≥1：32以上即有诊断意义[11]。李正秋等[12]报道，IHT实验的灵敏度为97.5%，显著高于ELISA检测法86.5%，其特异性70.9%不及ELISA检测法91.5%，二者联合检测可提高检测阳性率。该试验操作方法相对简单﹑快捷，但因其特异性不高，且与生殖道支原体存在交叉反应而未推广。

3.2.4 IFT试验

IFT试验是标记免疫技术中发展最早的一种。该法以培养基中生长的Mp菌落制作抗原印片，与被检血清(Mp—IgM﹑IgG抗体)孵育形成抗原抗体复合物，再用抗抗体的荧光标记抗体着色，荧光显微镜下观察，效价>1：16为阳性。有学者报道IFT试验检测Mp感染阳性率为64%，灵敏度为98.3%，特异性为87.5%，明显优于快速培养基法(阳性率26%，灵敏度为33.3%，特异性为85%)，两方法比较而言，该方法特异性较高，但需购置荧光显微镜才能观察，只适用于一般实验室[13-16]。

3.2.5 ELISA试验

ELISA试验利用酶标记抗体作为标志物，并将提纯的Mp膜蛋白P1﹑P116或P30抗原。吸附在固相载体表面，再用洗涤液将游离成分洗除，最后加入TMB底物后显色来判断结果。ELISA法是国内应用较为成熟的实验方法，目前临床上多应用商品化试剂盒来进行快速简便检测，Narita Mitsu等[17]研究认为ELISA法具有较好的准确度和特异性，可分别高达96%﹑98%，优于CFT法，是诊断Mp感染实用可靠的手段，并且敏感﹑快速，适合于各级临床实验室，可作为Mp感染的常规检测方法。

4 分子生物学检测

自1980年以来，通过实验室和临床研究，证实了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术检测Mp感染的可靠性，目前PCR技术也是国内外发展较快的检测支原体的方法之一。PCR可分为普通PCR﹑实时荧光定量PCR，而普通PCR容易被污染而出现假阳性；实时荧光定量PCR具有快速，特异性强，灵敏度高等特点且无交叉反应现象，对Mp感染的诊断价值优于普通PCR法。运用实时荧光定量PCR技术检测患者痰液﹑咽拭子﹑支气管灌洗液中的Mp-DNA，通过高温加热使模板的两条DNA链解链后，引物分别与模板DNA和荧光探针一起退火，通过基因扩增技术，可以在短时间内使含量极低的核酸片段扩展至数百万个拷贝，可检出≥10cfu／mL的Mp。研究[18-24]发现，PCR诊断Mp感染的阳性率为73%，明显高于培养法25%，但血清学阳性率为98.5%，PCR灵敏度不及血清学，但特异性能达到97%，在Mp感染早期诊断优于培养法和血清学试验。PCR技术大大提高了检测特异性，并且可了解Mp在患者体内感染及自我复制的情况，对早期检测Mp感染具有重要意义口。但其过于敏感，操作不当或环境因素容易受到污染会导致结果出现假阳性或假阴性，另外该技术要求特殊仪器设备，较高的人员素质，所以在县级医院中难以普及。

5 展望

综上所述，基于分离培养﹑抗原检测﹑抗体检测和基因诊断技术为Mp感染的诊断提供了非常有效的检测手段，但迄今为止还尚无统一的Mp实验室检测方法。由于各种检测技术参差不齐，各种检测手段都有优缺点，建议根据临床要求，选择合适的检测方法，如Mp初筛可选用灵敏度较高的ELISA法﹑确诊可采用特异性较好的分子生物学诊断方法，同时还可采用多种检测手段结合可提高Mp感染阳性检出率。相信随着Mp基础研究的深入以及检测技术的进一步发展，必将发现新的Mp检测靶点，并开发出更加特异﹑敏感的检测方法，从而能够准确﹑快速地诊断Mp感染。