分子技术在羊育种中的研究进展

林月霞,吕玉华,廖荣荣

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106)

加快发展肉羊产业,对促进现代畜牧业发展、提高农民收入和改善居民肉类消费结构具有重要意义。近年来,羊育种由注重生长性状向兼顾生长性状和肉质性状等多元化方向发展,特别是优质、专门化新品种(系)培育已成为现代羊育种创新的重点。 近年来,国内外已培育出多个肉羊新品种,如中国的南江黄羊、美国的波利帕羊、英国的剑桥羊、澳大利亚的道美羊和法国的夏洛来肉羊等。

良种是肉羊生产发展的基础,加快培育优质肉用优良品种是提高羊肉产量的重要前提,而目前利用现代育种技术,通过杂交创新将不同品种的优良性状聚合在一起是现代家畜新品种选育的主导方向。 加快羊优质新品种(品系)培育,需坚持常规育种、分子育种与杂交育种相结合[1]。 对数量性状的选择主要有两种方法:第一种是以表型剖析为基础的常规育种方法,该方法虽能取得一定的遗传进展,但前提是需要对每个世代大量个体的表型进行准确判断,这严重影响了选育的进展和准确性;第二种方法是借助分子标记的辅助选择育种法,此法可以较好解决第一种方法存在的问题[2]。 随着分子育种技术的发展以及绵羊和山羊基因组的完善,FecB、CLPG、MSTN 等重要基因相继被鉴定[3-5],并应用于羊的分子标记辅助选择育种。 随着高密度SNP(单核苷酸多态性)芯片的研制推广,澳大利亚和英国等养羊业发达国家先后建立起较大规模的基因组选择参考群体,并开展基因组选择等分子育种研究[6],与此同时,国内在羊分子育种方面也在不断加大研究力度。 本研究梳理羊分子育种技术的研究进展,同时提出关于羊育种的意见和建议,以期对羊育种事业提供一定的理论参考。

1 分子育种技术

1.1 分子标记

分子标记以其准确性、多态性等优点,在羊育种研究与生产中已经成功应用了数十年,对于阐述羊不同品种间和不同个体间的性状差异、解析相应的分子遗传基础起着重要的作用[6-8]。 当前应用比较广泛的分子标记主要有微卫星、单核苷酸多态性、插入缺失标记和数量性状基因座[4,6-7,9]。

微卫星标记(Microsatellite),又名简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR),是指均匀分布于真核生物基因组中的简单重复DNA 序列,由1—6 个核苷酸的串联重复片段构成,由于重复单位的重复数量在个体间呈高度变异性且变异数量丰富,因此微卫星标记的应用非常广泛[10]。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)主要指基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA 序列多态性变异,是畜禽可遗传变异中最常见的一种。 随着当前高通量测序技术和芯片技术等生物技术的发展,SNP 的检测已经非常便捷,也成为应用最广泛的一种分子标记。

插入缺失标记(Insertion-deletion,InDel)指根据同一物种或近缘物种不同个体间基因组同一位点的序列发生不同大小DNA 片段而设计的引物,是全基因组中同源序列发现的差异。 InDel 长度1—10 000 bp,具有基因组分布广泛、稳定性好、准确性高等特点,是基因精细定位和图位克隆中最为有效的标记类型之一[11]。

数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)指影响数量性状的一个染色体片段或特定染色体区域的微效多基因群,它为了解个体数量性状基因之间的互作关系提供了路径,QTL 定位是确定数量性状基因在染色体上位置的有效方法。

1.2 分子育种

基于分子标记的分子育种技术主要包括标记辅助选择(MAS)和全基因组选择(GS)。 标记辅助选择是指通过对分子标记的研究,根据分子标记来辅助选择其所控制的性状,从而达到选择某一优势特定性状的目的,又称分子标记辅助选择育种。 该方法为羊育种提供了有效的途径,极大地缩了短育种间隔,提高了育种效率[12]。 全基因组选择是利用覆盖全基因组的高密度分子标记进行选择育种的新方法,可通过早期选择缩短世代间隔、提高育种值估计准确性等来加快遗传进展,尤其对低遗传力、难测定的复杂性状具有较好的预测效果,从而真正实现基因组技术指导育种实践[13]。

2 生长性状研究

成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)因其在促肌细胞增殖中的作用,被认为是肉羊生长性能的功能候选基因。 通过PCR-PFLP 法,在422 只母羊中共检测到4 个SNP(g. 14752C > T、g. 45361A > G、g.49400A>G 和g.49587A>T)。 关联分析表明,携带g.49587A>T 基因型AA 的个体体重和胸围均显著高于TT 基因型绵羊。 FGFR1 在3 个不同年龄段的肌肉组织中均有表达,胎羔期的表达明显高于成年母羊。 研究证实[14],FGFR1 的g.49400A>G 和g.49587A>T 参与了生长发育相关性状调控,可作为提高藏绵羊生长性状的分子标记。

Pan 等[15]在探讨不同绵羊品种PLAG1 基因的保守性时,检测了该基因的两个InDel 变异体对中国鲁西黑头羊生长性状的影响,结果显示PLAG1 基因中的P2-del 30 bp 和P4-del 45 bp InDel 变异位点与绵羊体高等15 个生长性状显著相关。

Shi 等[1]在寻找与绵羊生长和肌肉发育相关基因的研究中,以杂交组合杜泊羊×小尾寒羊和杂交组合蒙古羊×小尾寒羊为研究对象,对背最长肌进行转录组分析和生物信息学分析,共鉴定出1 445 个差异表达基因(1 026 个上调,419 个下调),其中有38 个是生长性状相关基因、161 是与发育相关的基因,还有43 个是肌肉发育相关基因。

体型是反映绵羊生长和健康的重要指标之一。 Jiang 等[16]对湖羊肉用核心群的亲本(G1)和后代(G2)进行基因分型,对两组的体高、胸围、体长、尾长、尾宽进行GWAS(全基因组关联)分析,结果共检测到5 个与体高相关的SNPs 和4 个与胸围相关的SNPs。

MicroRNA(miRNA)在生长、发育和应激反应中起着关键作用。 通过mRNA 和miRNA 表达谱的深度测序比较表明,18 个miRNAs 和373 个基因在断奶前和断奶后的崇明白山羊中存在差异表达。 生物信息学分析表明,差异表达的基因参与了细胞过程、发育过程和生长过程。 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析显示,下调的基因在唾液分泌、胆汁分泌、血管平滑肌收缩和钙信号通路中富集。 在下调的miRNAs 中,两个(chi-miR-206 和chi-miR-133a∕b)与山羊肌肉发育相关,另一个与细胞增殖相关,RTqPCR 进一步证实下调的miRNAs(chi-miR-99b-3p、chi-miR-224 和chi-miR-10b-5p)在快速生长期(7 月龄)崇明白山羊的肌肉组织(心脏、脾脏或肾脏)中高表达[17],推测这几个miRNAs 与肌肉发育强相关。

3 繁殖性状研究

Ren 等[18]研究表明,AHRA 基因的24 bp InDel 变异与澳洲白绵羊的产仔数和活产仔数显著相关,该变异位点有助于绵羊产仔数和活产仔数的分子标记辅助选择育种,从而进一步提高绵羊的繁殖性能。LLGL1A 基因的21-bp InDel 与陕北白绒山羊的产仔数极显著相关[19],该变异位点可作为研究山羊产仔数的DNA 分子标记。

PRNT 基因是朊病毒基因家族的一员,编码一种在睾丸中特异表达的蛋白。 PRNT 基因最初被鉴定为睾丸特异性基因,在精子发生中发挥主要作用,而PRNT 基因mRNA 表达谱显示,其在陕北白绒山羊的睾丸中低表达,却在卵巢中高表达,对该基因序列进一步的研究表明,共发现有3 个SNP 位点,其中c.71A>G 位点的AA 基因型与产仔数极显著相关(P=0.006)[20]。 这些发现可为标记辅助选择高繁殖性能山羊提供潜在的DNA 标记。

对200 只3—5 岁的至少处于第三胎产羔期的萨尔达绵羊进行连续2 年监测,结果显示,MTNR1A 基因内检测到29 个SNP 位点,其中有5 个SNP 位点引起氨基酸的改变,位点g.17355452C>T(SNP16,rs430181568)和g.17355358C>T(SNP17,rs407388227)是连锁的且与怀孕周期显著相关,C∕C 基因型母羊的交配高峰比T∕T 基因型母羊早30 d[3]。 这一结果说明MTNR1A 基因新多态性与母羊繁殖性能恢复有关。

4 肉质性状研究

背最长肌的肌内脂肪含量和脂肪酸组成随着山羊的生长而发生变化,其也参与决定山羊肉的风味和营养价值。 在一项山羊肉质研究中,对采集自羔羊、青年羊和成年山羊的背最长肌组织DNA 进行测序,结果表明,在24 689 个Unigenes(Universal genes)中,有20 435 个Unigenes 被注释,在不同出生阶段鉴定出111 个注释差异表达基因,并通过序列聚类分析将其划分为16 种可能的表达模式。 采用GO(Gene ontology)功能分类分析,筛选出与脂质代谢相关的最高表达基因,并通过共表达分析确定了脂质代谢调控的节点基因,揭示了在山羊不同生长阶段肌肉发育和脂质代谢中具有功能调控作用的候选基因[21]。

刘学峰等[2]指出,CAPN1 和CAPN2 基因上的两个多态性位点C724A 和A601G 与德国美利奴羊肌内脂肪含量明显相关,说明这两个多态性位点可以作为培育优质肉用或肉毛兼用德国美利奴羊品种时的参考分子标记。 Yuan 等[22]研究指出,鉴定出的eQTL 具有显著性,与56 个胴体性状和脂肪酸谱相关。 例如,肌肉中的几个geQTL 定位于FAM184B 基因,肝脏和肌肉中的数百个sQTL 定位于CAST 基因,肝脏中的数百个sQTL 定位于C6 基因,而这3 个基因都与绵羊肌肉组成或者脂肪酸含量有关。

绵羊肉脂肪酸含量的遗传力为0.25—0.46,表明所评价性状存在较大的遗传变异,故而有可能通过选择改变脂肪酸谱。 Rovadoscki 等[23]在绵羊染色体1、2、3、5、8、12、14、15、16、17 和18 上发现了包含与脂肪酸组成相关的10 个相邻SNPs 的27 个基因组区域,每个区域可解释0.30%的加性遗传变异。 此外,这些区域还发现了23 个绵羊脂肪组成遗传机制相关联的基因,如DGAT2、TRHDE、TPH2、ME1、C6、C7、UBE3D、PARP14 和MRPS30。

5 遗传多样性研究

分子标记在群体遗传多样性研究和评价中也应用广泛。 在对四川省凉山地区6 个绵羊群体的遗传多样性研究中,王婷等[24]利用12 个微卫星标记计算绵羊群体的基因频率、有效等位基因数、杂合度及多态信息含量,以此来评估群体内遗传多样度,进而通过遗传距离聚类图、群体结构推测图、主成分分析及群体间分子方差分析等评估群体间遗传关系。 为了从分子层面解析我国青海、西藏、云南、甘肃和四川等5 个地区绵羊群体的遗传关系,胡亮等[25]使用绵羊600 K 芯片对这5 个地区的20 个藏系绵羊群体进行扫描分型,基于杂合度和近交系数分析藏系绵羊群体的遗传多样性,结果显示云南和西藏地区藏系绵羊能够单独聚成一支,且这两地区羊群的遗传多样性普遍低于青海、甘肃和四川地区的藏系绵羊;而青海、甘肃和四川地区的草地型绵羊混乱聚集在一起;此外,云南和西藏地区的藏系绵羊基本能保持地域特异性,而青海、甘肃和四川地区绵羊在遗传距离和群体结构上差异不大。

崇明白山羊是在上海市崇明区独特的地理环境和水土条件下经人工选择孕育而成的优良地方品种。Gao 等[26]对10 个家山羊品种进行了全基因组重测序,探讨了崇明白山羊的基因组特征和选择信号特征。该研究共鉴定出23 508 551个SNPs 和2 830 800 个InDels,进一步鉴定出崇明白山羊品种特异性的SNPs共271 713 个,InDels 共24 843 个。 此外,基于全基因组FST和聚合杂合度(Hp)计算,进一步鉴定了该山羊品种与其他9 个山羊品种之间的选择特征基因,这些基因与神经系统(C2CD3、DNAJB13、UCP2、ZMYND11、CEP126、SCAPER、TSHR 基因)、生长(UCP2、UCP3、TSHR、FGFR1、ERLIN2、ZNF703 基因)和毛色(KITLG、ASIP、AHCY、RALY 和MC1R 基因)显著相关。 结果表明,由于自然选择和人工选择,崇明山羊品种在神经系统方面可能与其他山羊品种有所不同。

6 全基因组选择育种

全基因组选择育种也是一种标记辅助选择育种方式。 该技术使用覆盖整个基因组的遗传标记,使所有数量性状位点至少与一个分子标记处于连锁不平衡状态,可通过早期选择而缩短世代间隔。 Gore等[27]指出,与传统方法相比,全基因组选择育种通常具有更高的年度遗传进展和更高的性价比。 遗传进展与交配方式也有关,与自然交配和传统选择法相比,利用繁殖技术和基因组选择的交配策略可以提高羊只对选择的反应。 该研究还发现,人工鲜精的授精策略所取得的遗传进展等优于自然交配策略和人工冻精输精策略。

动物繁殖技术如超数排卵和胚胎移植技术(MOET)以及后备母羊体外受精和胚胎移植技术(JIVET),已经被证明可通过增加选择强度和缩短世代间隔加速遗传进展。 Granleese 等[28]以澳大利亚绵羊为研究对象,基于增加优良性状、近交繁殖程度而优化的全基因组信息和配对选择策略,进而确定在育种计划中对个体配种的最佳生殖技术组合。 相对于传统的本交育种,利用MOET 技术和JIVET 技术的育种策略可增强母羊选择强度和缩短世代间隔,从而获得更高的年度遗传进展。 全基因组选择提高了幼龄候选羊只的选择准确性,从而进一步加速了遗传进展,使得全基因组选择策略比传统选择策略更精确[28-30]。

7 总结与展望

山羊和绵羊在改善人类生计中发挥着重要的作用,是肉、奶、纤维和兽皮的主要来源之一[31],特别是在干旱地区和贫困山区,山羊和绵羊的饲养可促进人民生活水平的提高。 我国拥有众多的地方山羊和绵羊品种资源,研究和保护群体遗传多样性是确保种业安全与发展的根本[32],品种资源是羊育种的宝贵素材,结合分子育种技术与常规育种手段,可以加速培育羊新品种(品系)。

在养殖生产中,羊的体尺性状已被广泛认为是生长和健康的重要指标,影响到喂养和管理以及对环境的适应[16,33-34]。 肌内脂肪含量影响着羊肉的风味和营养价值,瘦肉中的脂肪斑点和条纹被称为大理石纹,与多汁和风味等正相关。 最优肌内脂肪含量和脂肪酸组成对人体健康也有好处。 兼顾羊的生长发育与优良肉质性状的遗传改良是当前羊育种的主要目标之一。

高通量测序和全基因组关联分析为羊品种的遗传多样性和经济性状探索提供了新的思路和技术手段,便于挖掘优良基因、开发新的育种分子标记,通过标记辅助选择或全基因组选择育种,进而实现羊品种遗传改良。 基于分子标记的分子育种技术为提高羊育种效率做出了重要的贡献。 近年来兴起的分子设计育种也是分子育种的进一步演绎,主要是利用分子生物学和系统生物学关于基因功能和生物大分子调控网络知识来设计和改良畜禽品种,从而大大缩短育种时间[35]。 越来越多的成功应用预示着分子育种是未来羊育种的一个重要发展方向。