结核病免疫学检测方法的研究进展

卢珮

（崇左市人民医院，广西 崇左，532200）

结核病作为全球性公共健康问题，截止至2020 年，全球新发结核病例数高达700 万例。成功诊断、治疗可促使每年上百万结核病患者避免死亡，但最新数据显示[1]，据统计2000～2020 年可避免5400 万人死亡。当前对结核病检出持续存在一定漏洞。目前结核分枝杆菌特异性抗原分析特点为简单、成本低、操作方便及测定快速等优点，成为筛查结合病例有利方法，特别为中国、印度等资源受限国家[2]。目前对结核病诊断血清学研究领域中，国内外学者致力于寻找在结核病患者中能引起强烈抗体反应潜在血清诊断抗原，而新型结核病免疫学实验室检测技术不断出现。文章就对近些年来国内外结核病免疫学实验室检测方面技术进展如下分析，以促进优良实用的结核病诊断新技术在我国各级医疗机构普及应用，现报道如下。

1 结核菌素皮肤试验（TST）

TST 为一项迟发型超敏反应免疫试验。而结核菌素作为结核分枝杆菌代谢产物，可引起特异性反应。包括旧结核菌素、纯蛋白衍生物两种。Koch 发明旧结核菌素，从结核菌培养基提取，含有结核蛋白外并包括培养基及菌体等成分[3]。纯蛋白衍生物则是由Seibert 制备，包括结合蛋白，依据制取来源并分为数种。通过一定量PPD 经皮注射至体内，观察局部皮肤红肿硬结程度并判断反应强度[4]。当前认为TST 对活动性结核病及潜伏性结核感染诊断价值高。同时，伴随着现阶段卡介苗接种范围扩大，上述试验结果阳性并非可直接确诊为结核病，降低结核菌素试验阳性率。研究指出[5]，结核菌素试验相比较其他检测手段，阳性率高达76.5%，灵敏度为88.2%，特异性低至34.4%，表明TST 具有较高假阳性率。同时，种类不同PPD 试验结果也存在着不同。但TST 低廉、方便及快速特点下，成为欠发达地区结核病检测主要手段。

2 酶联免疫吸附试验（ELISA 法）

ELISA 原理是指抗原或抗体吸附在特殊固相载体表面，吸附于载体上抗原或抗体会保留原有免疫活性，随后添加样本，并对样本中受检物质与固相化物质因特异性的抗原抗体反应而相互结合。加入受检物质后并依据洗板除去非特异性结合物，添加既有酶活性又有免疫学活性酶标记抗原及抗体。再次洗板并添加底物与酶反应显色后，利用酶标仪读取酶标板孔中光密度值，依据光密度值并定性、定量分析。实验表明融合性的MPT64-Rv1985c 抗原可有效鉴别活动性肺结核、潜伏感染者，ESAT-6 可区分BCG 接种者及结核菌感染者。同时上述方式应用上有一定局限性，抗原抗体反应时，会因个体差异、边缘效应、抗原本身浓度及PH 等因素对两者结合效率造成影响。结核特异性抗原ELISA 检测灵敏度为60%～85%，特异度为80%～95%[6]。敏感性范围变化上，反应酶联免疫吸附试验不稳定性。快速、简便、准确血清学免疫诊断方式应用上受到临床广泛关注，可作为ELISA 发展指明方向。

3 斑点免疫胶体金渗滤法（TB-DOT）

TB-DOT 原理是采取斑点免疫胶体金渗滤技术并将提纯的Mtb 特异性膜蛋白作为抗原，降低固定于硝酸纤维膜上，并将含有抗外膜蛋白抗体被检血清标本时，在毛细管层析作用下与特定抗原结合，加入吸附作用胶体金颗粒，依据反应是否出现红色斑点判断是否感染结核病[7]。当前特异性膜蛋白应用上包括MPB64、ESAT-6、14kD 等抗原。结核分枝杆菌抗体检测中胶体金免疫层析法应用期间具有显著优势，如耗费时间短、成本低以及操作简便等，被广泛用于大样本量筛查中，但仍然存在一定假阳性、假阴性。报道提示[8]，对结核抗体检测敏感性、特异性分析上为10%～90%、47%～100%，而不同研究上试剂、方法之间有一定差异性[9]。因此，上述检测项目归为一类辅助诊断方式，配合痰细菌学、影像学及临床表现等，可提高临床结核病诊断率，协助应用于早期诊断中，可指导患者拟定出合理治疗方案，改善结核病患者预后。

4 结核感染T 细胞斑点试验（T-SPOT.TB）

T-SPOT.TB 定义：利用机体T 淋巴细胞并受到毒力的TBAg刺激后，活化分泌结核分枝杆菌特异性γ干扰素效应T 细胞，并检测、计数效应T 细胞数量，用于评估机体是否感染结核分枝杆菌[10]。试验中，TBAg 可作为致病结核分枝杆菌RD1 区上Rv3874 编码的培养滤液蛋白10、Rv3875 编码的早期分泌靶向抗原6。研究指出[11]，T-SPOT.TB 试验下，对378 例结核分枝杆菌培养阳性患者、824 例体检健康者检测结果得出，T-SPOT.TB结果下，阳性诊断活动性结核敏感性、特异性维持在91.0%、75.2%。对结果深度分析结果得出，依据TBAg/植物血凝素斑点数的比值并对活动性结核、潜伏性结核感染区分，整体效果优于T-SPOT.TB 斑点技术对阳性结果判断，并对该项比值诊断肺外结核时有一定参考价值[12]。伴随着近些年来T-SPOT.TB 不断更新、应用，新型T 细胞检测技术（ELISPOT-IL-2 技术）广泛应用，基于T-SPOT.TB 基础上，以原核表达结核分枝杆菌标准菌株PPE36-p27 蛋白为刺激原，可刺激机体产生细胞因子IL-2，并通过固相载体上包被的抗人IL-2 单克隆抗体，后加入生物素标记IL-2 单克隆抗体，分别结合后并添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，形成固相抗人IL-2 单克隆抗体-待测抗原-生物素标记IL-2 单克隆抗体-HRP 标记的链霉亲和素复合物，洗涤后显色，并对形成斑点观察。伴随着T-SPOT.TB 多种改进技术在后期进一步优化，被用于结核病诊疗，上述新方法中仍需进一步深入研究。

5 蛋白芯片技术

蛋白芯片技术定义：将不同目标蛋白质依据预先设置排列顺序固定于各种载体表面，并做成微阵列检测芯片，分析抗原抗体高度特异性结合特点，并对特定荧光物质的针对芯片上蛋白质TBAg 或抗体与检测芯片反应，洗涤并去除未与芯片上蛋白质特异性结合荧光抗原、抗体后，利用激光共聚扫描技术、荧光扫描仪检测芯片上各点荧光强度，依据荧光强度，并分析各种待测样本中蛋白质。目前蛋白质芯片被用于寻找新药作用靶点、肿瘤标志物检测及科研等方面[13]。研究指出[14]，蛋白质芯片筛选脑脊液120 种细胞因子，并检测83 种细胞因子，分析62 例患者脑脊液因子含量，可得出γ-干扰素、白介素-8 及单核细胞趋化蛋白-2 作为结核性脑膜炎诊断性细胞因子。研究指出[15]，蛋白质芯片检测420 例结核病患者血液标本，结果显示，涂阳肺结核阳性率76.15%，结核蛋白质芯片固定TBAg 蛋白16000、38000、结核分枝杆菌特异性细胞壁脂多糖抗原三抗体联合检测下，结核病阳性率、诊断准确率显著提升，被用于结核病诊断中有一定辅助价值。但近些年来结核蛋白质芯片法作为一类新型研究方式，对临床诊断、疗效评估及科学研究仍需进一步分析。

结核病免疫学检测手段日趋丰富，多种免疫检测方式应用及联合成为结核病诊断新趋势。但目前临床应用有一定局限性，精确、可靠及快速及低廉检测手段仍需探索设计。同时，部分免疫学检测仍需临床大规模探索验证，才能不断改良及完善。尽管针对结核病免疫学检测发展过程中仍然面临挑战，但伴随着结核病免疫学机制研究及生物学发展不断深入，结核病免疫检测被广泛应用，对结核病早诊断、早干预及早治疗具有重要意义。总的来说，结核病免疫学检测对结核病防治意义深远，同时仍需科学家发现更加有效检测方法。