肝纤维化发生及逆转途径的研究进展

苏 静，胡以平

(海军军医大学细胞生物学教研室，上海 200082)

肝病是一项全球范围内引起广泛关注且非常严重的公众健康问题，全世界每年约有200万人死于肝病[1]。引起肝病的潜在病因主要包括病毒，代谢，药物毒性，自身免疫等，持续的刺激使得患者从最初的慢性肝损伤逐步发展到晚期肝硬化甚至肝癌。在慢性肝损伤中多伴随着肝纤维化，而进行性肝纤维化的一个共同结果是肝硬化，其中中国占全球肝硬化死亡人数的11%[2]。现阶段，晚期肝病的治疗手段依旧主要依赖器官移植，但受其资源限制性，晚期肝病的治疗面临许多困难。目前在早期实验和临床研究中已经发现了肝纤维化的可逆现象，如果临床治疗中能提前发现并在此阶段进行肝纤维化的逆转干预，将对肝病治疗具有重大意义。本文就目前肝纤维化逆转的主要进展进行综述，以期为肝纤维化相关疾病的治疗和进一步研究提供理论指导。

1 肝纤维化发生的病理生理机制

肝纤维化是肝脏在受到外界刺激后发生的自我修复和伤口愈合，这是一个复杂的多细胞反应的结果。国内肝病多数是由于大量饮酒和慢性乙型、丙型病毒性肝炎感染引起的，但不管是何种病因，肝纤维化的形成过程非常相似，主要包括长期慢性实质损伤，持续激活炎症反应和氧化应激，细胞外基质大量沉积，纤维瘢痕形成等，共同破坏肝脏的正常结构和功能[3]。

纤维化的发生始于效应细胞的激活。肝脏受到损伤后，肝内细胞的死亡以及免疫细胞的浸润引起炎症和纤维化信号的级联反应激活。细胞损伤会释放危险相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，是一种细胞内异质分子，如游离DNA、ATP、核因子(high mobility group protein B1，HMGB1)，热休克蛋白等，或许还有病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPS)[4]，如 酒 精，革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)等，这些相关模式刺激并激活一些炎症细胞如巨噬细胞、T 细胞、自然杀伤细胞(natural killer T cell，NKT)、库普弗细胞等，分泌如白介素(interleukin，IL)-1β、-18、-13， 干 扰 素γ， 肿 瘤 坏 死 因 子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α) 等 促 炎 因 子 和CCL2(C-C motif chemokine ligand 2)等趋化因子，进一步诱导淋巴细胞，单核细胞等在损伤处的募集和激活。在炎症微环境下，肌成纤维细胞活化和增殖，并在趋化因子的作用下迁徙，肌成纤维细胞是产生细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主力来源。肌成纤维细胞的来源可根据病因的不同，大致分为4种，以静息期的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)激活分化为主，α-平滑肌肌动蛋白(actin alpha 2，α-SMA)和I型胶原的表达增加是活化的肝星状细胞(activated hepatic stellate cells，aHSCs)的特征标志；还有内源性门静脉成纤维细胞、骨髓来源细胞和肝实质细胞来源，可经过上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)产生肌成纤维细胞，通过分泌细胞外基质蛋白等对肝纤维化进展产生重要作用。

在进展性肝慢性损伤中[5]，ECM 的生成降解平衡状态被打破而大量沉积是肝纤维化的重要特征。活化的巨噬细胞、肝星状细胞，以及其他肌成纤维细胞可以释放肿瘤生长因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)，TGF-β1 是诱导纤维胶原(主要是I 型和III 型)、α-SMA、层黏连蛋白和纤维连接蛋白产生的最有效的细胞因子，同时该因子也会促进肌成纤维细胞存活和增殖。肝星状细胞可以分泌基底膜蛋白酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)包括MMP-2、MMP-3和MMP-9和间质胶原酶MMP-13，aHSCs可以分泌金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteases，TIMP)1和2。MMPs是一种钙依赖性酶，能特异性降解胶原和非胶原性ECM底物，而在肝损伤期间金属蛋白酶组织抑制剂的持续产生可以抑制基质金属蛋白酶的活性，使得金属蛋白酶对多余的纤维胶原去除效率降低，打破基质降解合成的平衡，从而促进细胞外基质的沉积。

在肝纤维化的典型特征中，除了ECM的大量沉积，还会发生窦道毛细血管化，这主要是由于HSC激活后，合成和释放血管生成介质，如VEGFA(vascular endothelial growth factor A)，PDGF(platelet derived growth factor)等，同时分泌纤维胶原I 和III 在剥离间隙中取代IV 型胶原引起的；胆管反应，在慢性肝损伤的情况下，持续的炎症和氧化应激使得肝细胞增殖和肝干细胞分化被抑制，短暂扩增的肝祖细胞被迫主要分化为激活和应激抵抗的胆管样细胞或反应性胆管细胞。

2 肝纤维化的可逆性分析

目前肝纤维化的逆转已经在许多实验研究和临床治疗中得到验证。 大量的基础研究， 包括四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)，硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)，胆管结扎等诱导的动物肝纤维化模型[6]，以及丰富的临床治疗数据[7]，均展示了不同病因引起的慢性肝病中出现肝纤维化消退现象。正如在大鼠慢性CCl4损伤中，晚期肝纤维化在损伤停止后被重塑到接近未损伤肝的水平[8]；Poynard 等[9]报告，所有慢性丙型肝炎患者在治疗后纤维化发生率均有下降。

在肝纤维化的逆转过程中，标志性特点是胶原纤维降解，肌成纤维细胞、炎症和纤维化细胞因子减少，肝功能改善以及肝生理结构的恢复。具体体现在，在去除肝脏外界刺激的影响下，由于肝脏本身的再生能力影响和肝坏死细胞的减少，使得炎症因子和促纤维化因子分泌也减少，同时活化的肝星状细胞会逐渐走向衰老和凋亡，或转为静息状态，TGF-β和TIMP1表达水平降低，MMPs活性增加，加快ECM降解，促进肝脏ECM的重塑。

3 肝纤维化逆转途径研究

3.1 减少活化的肝星状细胞数量

在正常肝脏中，HSCs约占肝驻留细胞总数的15%和肝非实质细胞的30%，通常表现为静息状态并含有脂滴[10]。但在肝脏受到损伤时，不同炎症因子导致HSCs 激活或转分化为具有高度增殖性和收缩性的肌成纤维细胞，持续的HSCs 激活释放的细胞因子可增强炎症和纤维化组织反应。目前靶向HSCs 的治疗已经取得了较多成果，主要有两种治疗方法。

3.1.1 促进HSCs 衰老和凋亡利匹韦林(Rilpivirine，RPV)，是一种抗逆转录病毒药物，在肝脏毒性和脂质特性方面更具有安全性。研究者已在细胞和实验动物层面证明RPV 能够通过JAK-STAT 通路调节STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1)和STAT3 之间的平衡，通过STAT1 的选择性调控诱导HSCs 凋亡，可在不同的慢性肝损伤实验模型中，改善炎症和肝纤维化，凋亡HSCs 分泌的IL-6 还能特异性激活肝细胞中STAT3，以增强肝再生[11]。aHSCs 还具有以NF-kB(nuclear factor kappa B)依赖的方式增强生存率的特征，从而促进纤维化，因此，抑制NF-kB 通路可能通过诱导HSCs 凋亡来抑制肝纤维化[12]。除此之外，CCN家族基质细胞蛋白，富含半胱氨酸的蛋白61(CCN1/CYR61)通过减弱TGF-β信号通路来促进HSCs的衰老和凋亡[13]。纤维连接蛋白肽[14]可以通过aHSCs 凋亡导致自限性反应，最终限制慢性纤维化的发展。

3.1.2 抑制或逆转HSCs 活化成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是在肝损伤中表达增加的主要生长因子家族之一，FGF信号除了加速损伤肝脏的再生外，还会导致纤维化的发展。研究表明CCL4诱导的肝纤维化在FGF1/FGF2 缺陷小鼠中显著降低[15]；2020 年Wang 等[16]的研究再次证明，抑制FGFR(fibroblast growth factor receptors)信号通路通过抑制促炎细胞因子的分泌和MMPs 的表达，特别是MMP9 的激活，抑制单核细胞对HSCs 的黏附，且在炎症阶段抑制FGF 信号以抑制HSCs 的活化来减轻纤维化的进展。胶质细胞系来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，是TGF-β超家族的一员，可通过Ret/ALK5 受体以及AKT(AKT serine/threonine kinase 1) 和Smad(mothers against dpp)通路诱导HSCs 激活，阻断GDNF 可抑制HSCs 的激活，而抑制纤维化进展[17]。目前多项研究表明过氧化物酶体增殖物激活 受 体(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)是HSCs激活和表型改变的关键介质，可影响HSCs处于静息期的状态。Lu等[18]研究发现，大鼠在低氧刺激下引起肝纤维化，HSCs 活化标记物增多，同时伴随着PPARγ表达的降低，而通过体内外加入PPARγ激动剂可以减少HSCs 活化和胶原沉积，抑制肝纤维化。

3.2 促进细胞外基质降解

肝纤维化的一个重要特征是肝脏结构的破坏和过度的ECM合成和沉积。正常肝脏中ECM的含量非常有限，但其构成了一个复杂的结构支持性蛋白质网络，在调节组织稳态、重塑和再生中发挥重要作用。ECM成分的交联，特别是纤维胶原和弹性蛋白，与纤维化进展密切相关。越来越多的证据表明，ECM降解可能参与肝纤维化的自发溶解。

3.2.1 减少胶原产生减少胶原产生是肝纤维化逆转的重要策略之一。C9复合物[19]可以抑制LARP6(La ribonucleoprotein 6)与编码I 型胶原的mRNA 结合，从而抑制动物模型中的纤维化发生，还可以减少HSCs的I型胶原分泌。趋化剂受体同源分子[20](prostaglandin D2 receptor 2，CRTH2)是前列腺素D2 的质膜受体，锚定的CRTH2可以与LARP6的胶原mRNA识别序列结合，并促进细胞中胶原mRNA的降解。Fan等[21]研究发现ECM1敲除小鼠可自发发展为肝纤维化，并在第2个月时死亡；而且ECM1可通过与αv整合素相互作用使TGF-β保持在非活化状态以抑制肝星状细胞活化和肝纤维化的发生。抑制素家族中的β-抑制素2 随着肝纤维化的进展而表达增加，小鼠模型和体外实验均表明降低β-抑制素2 的表达可减少胶原的表达并改善纤维化[22]。也有研究表明，相比于减少胶原的产生，增强金属蛋白酶的活性，减弱其抑制剂的表达在肝纤维化回归中更为重要。

3.2.2 增强ECM的降解在纤维形成过程中，I型、III型胶原以及纤维连接蛋白逐渐取代正常肝脏中IV 型、VI 型胶原，这种高度稳定和交联的ECM分子可以被MMP特异性降解。TIMP可导致基质金属蛋白酶的催化活性下降，多项研究表明TIMP的持续产生似乎是纤维化进展的关键。

早在2003年[23]发现腺病毒介导的MMP1表达可以改善TAA诱导的大鼠肝纤维化，并提出ECM的降解伴随着aHSCs的抑制和凋亡。在CCl4和胆管结扎诱导的肝硬化大鼠模型中，腺病毒载体介导的MMP-8过表达[24]可以逆转纤维化，并改善肝功能和肝内血压，同时降低TGF-β 表达，而MMP-9 和HGF(hepatocyte growth factor)表达升高。MMP-9 突变体[25]可作为TIMP-1拮抗剂以减弱CCl4诱导的纤维化；除此之外，Tsay等[26]提出，抑制肝细胞中miR-221-3p 会导致沉积的细胞外基质的更快溶解；下调miR-221-3p 可诱导肝细胞中GNAI2 的表达，抑制CCl2的分泌，从而导致HSCs活化减少，改善肝纤维化。

3.2.3 改变ECM 的空间构象和基质刚度赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase，LOX)和赖氨酸氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)都在肝纤维化的缺氧环境中表达上调，其赖氨酸残基可诱导纤维蛋白的共价交联，增加对ECM降解的抵抗，促进肝纤维化的稳定和积累。近来Klepfish 等[27]提出，使用一种新型抗LOXL2 中和抗体GS3411 能使胶原降解后的空间构建发生变化，使得单核来源的巨噬细胞等分泌的MMPs 更易发挥作用，加速和增强了胶原蛋白的降解，有效缓解肝纤维化和促进纤维化逆转。在肝脏中，基质刚度的升高可以激活HSCs 或成纤维细胞，进而导致ECM的沉积，形成正反馈回路。所以有研究[28]表明，抑制ROCK(Rho kinase)信号，靶向YAP(Yes1 associated transcriptional regulator)或直接靶向α-SMA的表达等可以降低纤维组装，减轻肝纤维化。

3.3 免疫细胞及免疫反应是把双刃剑

在纤维化进展过程中，非实质细胞，如肝间充质细胞，免疫细胞和内皮细胞是纤维化微环境的关键细胞组成部分，通过引发炎症等参与伤口愈合和组织修复，并调节HSCs 转分化和调节ECM 重塑来促进ECM 的积累。免疫反应在纤维化疾病中起着重要作用，对免疫细胞以及其信号通路的系统研究仍然是开发新疗法的基础。

3.3.1 巨噬细胞具有双重作用肝脏中含有大量组织驻留的巨噬细胞，称为库普弗细胞(KCs)，在生理和病理上可维持肝脏免疫稳态。库普弗细胞的激活和单核/巨噬细胞的募集是控制纤维化起始、持续和解决的关键事件。在损伤的肝脏中，巨噬细胞表型随炎症、纤维化的持续时间和程度而动态变化，具有较高的可塑性且具有异质性表型。

肝巨噬细胞具有双重功能，如新鲜浸润的Ly-6C+单核细胞来源的巨噬细胞具有促炎表型，加重炎症。因此，使用抗CCl2或CCR2[29](C-C motif chemokine receptor 2)的拮抗剂可以抑制对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)给药后早期单核细胞浸润从而改善肝损伤，发挥抗纤维化作用。在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者[30]中，CCR2/CCR5 双抑制剂治疗可阻止单核细胞来源的巨噬细胞招募和星状细胞激活，并抑制纤维化。而在最近的两项Ⅱ期临床试验的报告中强调了这一概念，这些报告显示炎症信号的特异性抑制剂丝氨酸/苏氨酸激酶ASK1 抑制剂selonsertib[31]和双CCR2/CCR5 抑制剂cenicriviroc[32]会靶向NASH和纤维化患者的巨噬细胞。虽然这两种药物可能针对巨噬细胞的不同功能，但均具有抗纤维化作用。

然而，一些肝纤维化的小鼠模型显示，肝巨噬细胞在纤维化的进展和消退过程中具有相反的功能。浸润单核/巨噬细胞也通过产生抗纤维化介质如MMP12 和MMP13 促进纤维化消退，或吞噬肝细胞碎片诱导Wnt3a(Wnt family member 3A)的表达而有利于实质再生[33]。CD11b(integrin subunit alpha M)双胎菌毒素受体转基因小鼠中巨噬细胞的选择性消耗能够阻止了慢性损伤后的纤维化发展，但它也能延缓损伤停止后的修复过程[34]。并且巨噬细胞和HSCs双向调控，活化的HSCs有助于巨噬细胞表型改变为促炎症和促纤维化，而在HSCs[35]中抑制p38(p38 kinase)可以消除这种巨噬细胞表型的变化，巨噬细胞浸润的消耗或阻断会减少星状细胞的活化和纤维化。所以浸润的单核/巨噬细胞可以环境依赖的方式具有促纤维化性和抗纤维化性。

3.3.2 其他免疫细胞除此之外，中性粒细胞，适应性T细胞和B 细胞，NKT 细胞等免疫细胞在肝纤维化中同样起重要作用。中性粒细胞[36]是一种先天免疫细胞，通常会加剧炎症从而促进纤维化的进展，但也有减轻肝脏炎症和纤维化的能力，在小鼠肝纤维化模型中通过MMP 的表达产生抗纤维化作用。适应性免疫系统中的T 细胞和B 细胞在慢性损伤的肝脏中都很丰富。B细胞已被鉴定为肝纤维化中的促纤维化细胞成分，可能通过调节HSCs-单核细胞的相互作用来调节早期纤维化[37]。T细胞[38]的贡献长期以来一直被Th1/Th2理论所解释，其中Th1和Th2 细胞分别具有抗纤维化和促纤维化作用。NKT 细胞[39]也是肝损伤、修复、炎症和纤维化过程中免疫反应的中心组成部分，其在纤维化中的功能会受到不同背景的影响。在CCl4诱导的肝纤维化中，NKT缺陷小鼠更易发生肝纤维化；浸润的NKT细胞增加NKG2D 配体的表达激活HSCs，改善肝纤维化。由此可见，免疫系统中免疫反应所在的微环境和细胞表型在肝纤维化的逆转中同样关键。

3.4 抑制纤维化相关信号通路

肝纤维化发生发展过程极其复杂，各种炎症，趋化因子的刺激不仅能够改变肝脏微环境，也通过不同的信号通路发挥作用。广泛研究的TGF-β，YAP-TAZ 等通路均与肝纤维化密切相关。

在哺乳动物中，转化生长因子TGF-β具有TGF-β1、TGFβ2和TGF-β3三种不同亚型，其分布具有细胞类型差异性，能够调节细胞凋亡、增殖、分化、迁移和侵袭等过程。TGF-β1在健康和慢性损伤的肝脏中被广泛研究，并在多项临床研究中作为治疗靶点。YAP/TAZ通路在肝纤维化过程中的正调控和负调控存在相互矛盾的数据。Liu等[40]的研究证明了维替泊芬抑制YAP可加剧肝纤维化。最近有研究表明，抑制YAP/TAZ信号可以减弱肝纤维化，如肝细胞特异性YAP 和YAP/TAZ 敲除可以减少纤维生成[41]。

3.5 其他疗法

近年来，干细胞移植已成为一种有效的肝病治疗方法。鹿角干细胞[42](antler stem cells，ASCs)移植可有效减轻肝纤维化，抑制星状细胞的活化，减少脂肪变性，增加肝细胞再生，减少炎症，显著增强肝功能，并且ASCs 具有易于获得、增殖能力高和体外扩增的优势。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促进肝细胞再生，增强肝功能，逆转肝纤维化[43]。

在肝细胞和LSECs中，自噬主要作为一种抗氧化和细胞保护机制保持细胞稳态。LC3 相关吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)[44]，是一种非典型的自噬形式，在啮齿动物 慢性肝损伤期间防止肝脏和全身炎症，具有抗纤维化作用。自噬[45]的促纤维化作用直接依赖于HSCs活化过程，自噬可以诱导肝纤维化中HSCs 的激活和增殖，而用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或特异性小干扰RNA(siRNA)阻断自噬相关基因可减少HSCs激活，减轻纤维化程度。

4 小结及展望

随着肝脏损伤和纤维化机制研究的深入，目前大家普遍认为肝纤维化处于一个可逆转期，在这一时期进行干预，肝脏可回归相对健康的状态。因此肝纤维化的早期诊断和可逆转期的有效把握对肝脏疾病的治疗非常重要。由于体内很多细胞和分子在不同的肝脏微环境下有双重作用，所以关于机体微环境，细胞表型和机制的关系的研究，对肝纤维化的靶向治疗至关重要。

除此之外，肝损伤和纤维化是一个各因子互相交联，互相作用的复杂系统。而研究时，往往是从细胞模型或是动物模型入手，而这还不能完全代表人类疾病，并且模型建立比人类疾病要快得多，这肯定会影响细胞对损伤的反应。它们通常只反映了发病机制的某些方面(例如，蛋氨酸胆碱缺乏饮食模型中的严重炎症和纤维化，且缺乏胰岛素抵抗、肥胖或心血管共病)，很少纳入完整的病因特异性机制。并且有的药物具有多种靶点，为避免引起非必要性损伤，综合分析每一种药物的毒副作用，调整不同的整合方案，将不同优势治疗方案结合是进行肝纤维化逆转的有效解决手段，例如嵌合抗原受体CART 治疗。技术的进步也提供了更多了解纤维化疾病的研究方式，如单细胞RNA测序、空间蛋白质组学、多参数组织学分析或系统生物学方法，深入了解病理机制，将有助于克服困难，为特异性靶点的寻找和有效的肝纤维化治疗铺平道路。