HBV相关肝细胞癌的血液生物标志物研究进展*

刘志礼 宜建英 张星鑫 刘树业

1 天津市第三中心医院检验科 300170； 2 天津市第一中心医院检验科； 3 孝义市人民医院检验科

据估计，全世界有20亿人感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，其中大约2.6亿人仍然处于持续感染[乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性的HBV携带者]。每年约有887 000人死于由HBV感染引起的肝硬化和肝癌[1]。大多数HBV感染患者在肝纤维化进展后发生肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC的良好候选生物标志物是疾病特异性分子，如HCC细胞释放到相对容易收集的体液(如血液、唾液等)中的核酸和蛋白质。目前，HCC的临床常用血清生物标志物有甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP) 和维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ诱导的蛋白(Protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ, PIVKA-Ⅱ)，也称为脱-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy prothrombin,DCP)。这些血清生物标志物水平升高的患者，可以通过详细的影像学检查或肿瘤组织活检来确诊HCC。如果不考虑成本，使用微创、高性能的生物标志物进行监测可以为需要早期筛查HCC的患者提供显著的临床益处。生物标志物在识别需要频繁影像学监测的HCC高危患者方面也有作用。因此，开发更好的生物标记物和追求生物标记物的性能将直接有助于改善肝癌患者的预后。除了HCC的肿瘤标志物外，HBV基因型、HBV基因组突变、HBV感染肝细胞的宿主基因组突变以及肝癌细胞的基因表达模式也可以作为HBV相关性肝癌的候选标志物[2]。基于此，本文总结了HBV相关HCC的新型血液生物标志物，特别是聚焦于肝癌发生过程中HBV基因组和糖基化的标志物。

1 HBV对肝细胞的致癌作用

许多慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)病例会发展为肝硬化，然后发展为HCC。HBV慢性感染致癌的分子机制涉及DNA损伤的积累、基因组/表观遗传改变、氧化应激和细胞衰老。病毒基因组以宿主染色体外共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的形式存在于HBV感染的细胞中。HBV基因组编码蛋白X(HBV genome encodes protein X, HBx)促进病毒基因组的转录。在HBV相关的肝癌组织中经常观察到HBV DNA片段整合到宿主染色体中，整合的DNA经常包括HBx基因。HBx基因表达的融合蛋白整合到宿主DNA中，具有反式激活功能，通过该功能激活宿主基因的表达，这被认为是肝癌发生的原因。

HBV感染一旦发生，就不能从肝细胞中完全清除。治疗的目的是实现所谓的“功能性治愈”，即HBsAg丢失和cccDNA(HBV稳定的染色体外转录模板)的数量减少。CHB感染的治疗方法是注射干扰素(interferons, IFNs)或使用抗病毒药物核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]进行治疗。NAs可以显著抑制HBV DNA的复制，因此在治疗期间很难检测血液中HBV DNA水平的变化。血清乙型肝炎核心相关抗原(Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)反映肝细胞中cccDNA的数量和转录活性，因此是监测接受NAs治疗的CHB患者的有用指标。

2HBcrAg

HBcrAg由前核心/核心开放阅读框编码的三种蛋白组成，即乙型肝炎核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)、22kDa的前核心蛋白和乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)组成。HBcAg蛋白包含在称为Dane颗粒的传染性完整病毒体中。除此之外，含有HBcAg、前核心蛋白和HBsAg的空颗粒(无病毒DNA的颗粒)形成并从肝细胞中释放出来。此外，HBeAg穿过肝细胞膜并分泌到血液中。空颗粒和HBeAg均在与Dane颗粒分离的过程中从肝细胞中释放出来。即使在抗-HBc或抗-HBe阳性的患者中，HBcrAg检测也能检测到抗原，而不用考虑前核心突变，并且HBcrAg水平与血清和肝脏中的HBV DNA水平以及肝脏中的cccDNA水平相关。HBV DNA检测已用于临床实践，但其成本和较长的检测时间限制了其在不同地区的使用。此外，肝内cccDNA检测需要侵入性肝活检，这使得连续监测变得困难。因此，HBcrAg检测作为一种可靠、易于使用且成本低廉的检测方法，在CHB患者管理中的重要性已得到广泛评估[3]。

在CHB患者中，HBeAg阳性患者的血清HBcrAg水平显著高于HBeAg阴性患者，并且不仅与血清HBV DNA水平相关，而且与肝内HBV DNA和前基因组RNA相关，此外还与肝内cccDNA水平及其转录活性相关[4]。据报道，无论HBeAg状态如何，与血清HBsAg和HBV RNA相比，血清HBcrAg水平与肝内cccDNA水平的关系更为密切[5]。长期监测血清HBcrAg水平适用于NAs治疗期间检测不到HBV DNA的CHB患者，HBcrAg在预测HBsAg丢失和治疗后HBV再激活的风险方面可能很有价值。此外，停止NAs治疗后血清HBcrAg水平高可预测1年内的病毒学复发[6]。因此，血清HBcrAg被视为考虑停用NAs的有用生物标志物之一。同样，CHB患者在PEG-IFN治疗前和治疗期间的血清HBcrAg可能是实现HBeAg血清转换和/或HBV DNA抑制的适当指标。

CHB患者的血清HBcrAg水平与HCC发展相关，并且是CHB患者发生HCC的独立预测因子，低HBsAg/高HBcrAg水平的组合明显与更频繁的HCC显著相关[7]。此外，HCC患者的高肝内cccDNA和血清HBcrAg水平与较差的无复发生存率显著相关。因此，HBcrAg适用于筛查HBV再激活和HCC发展风险高的CHB患者。最近，Inoue等人证明用于HBcrAg检测的全自动、高灵敏度的化学发光酶免疫分析比传统的HBcrAg检测灵敏度高约10倍，甚至更适用于监测cccDNA的转录活性和检测肝炎发病前的HBV再激活[8]。由于不需要任何特殊技术，并且能在30min内提供结果，未来有望应用于临床和研究。

总体而言，血清HBcrAg可以预测临床结果，如HBeAg血清学转换、对治疗的反应、HBV 再激活和HCC发展的风险。

3 AFP-L3

AFP是由发育中胎儿的卵黄囊和肝脏大量产生的血清蛋白，它的产量在出生后下降，而在成年人中几乎没有。HCC患者血清中AFP水平升高，因此AFP被用作肝脏肿瘤标志物。另一方面，在肝脏炎症的情况下AFP会随着肝细胞再生而增加，降低了AFP作为肿瘤标志物的特异性[9]。AFP被认为是由具有高增殖潜能的成熟肝细胞产生的，因为大多数表达AFP的细胞增殖细胞核抗原呈阳性。

为了解决AFP的特异性问题，研究人员重点研究了AFP的各种糖基化形式的疾病特异性。聚糖是继核酸和蛋白质之后的第三种生物高聚物，具有由糖苷键连接的单糖组成的链状结构。已知聚糖结构具有器官特异性，细胞表面聚糖结构会因组织条件、疾病和细胞转化而改变。对AFP糖基化的分析可以定性评估肿瘤表达的蛋白质，而不仅仅是它们的数量。1981年Breborowicz等人报道了HCC患者血清中AFP糖基化水平的特征性改变[10]。1990年，根据岩藻糖基化AFP对小扁豆凝集素的亲和力，Taketa等人将其分为小扁豆凝集素非反应性(L1)、弱反应性(L2)和强反应性(L3)3种，结果显示AFP-L1主要在慢性肝炎和肝硬化中增加，而AFP-L3在HCC中增加[11]。Yamashita 等人报道仅血清AFP-L3即可预测HCC的预后[12]。由于HCC的多样性，AFP、AFP-L3 和PIVKA-Ⅱ这三个标记中哪一个是阳性因病例而异，这种趋势在早期HCC中尤为明显。因此，研究人员试图通过使用三个或其他临床参数的互补组合来提高诊断和预后性能。GALAD评分由五个参数组成：G(性别)、A(年龄)、L(AFP-L3)、A(AFP)和D(DCP)。GALAD评分是高度客观的，对于不同国家的HCC检测具有相似的有用性[13]。BALAD评分和 BALAD2评分是通过将胆红素和白蛋白水平添加到上述三个肿瘤标志物而创建的指标。BALAD评分可用于预测HBV相关肝癌的预后，BALAD2评分还可以预测各种病因慢性肝病患者的肝癌预后。

4M2BPGi

Mac-2结合蛋白糖基化异构体(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一种Mac-2结合蛋白(M2BP)，其表面有一条糖链，能够结合紫藤花(Wisteria oribunda, WFA)凝集素。M2BPGi 是通过对慢性丙型肝炎患者血清中糖基化的综合分析确定的，其血清水平与患者纤维化进展之间存在显著相关性。顾名思义，M2BP与Mac-2结合，Mac-2是一种由巨噬细胞和库普弗细胞表达的半乳糖结合蛋白。据报道，乳腺癌、肺癌、胰腺癌和HCC[14]患者血清中的高M2BP水平与不良预后相关。M2BP的来源是肝星状细胞，M2BP在血液中形成环状多聚体，其大表面积使其易于糖基化。M2BP位于库普弗细胞上，M2BPGi的刺激诱导库普弗细胞表达Mac-2，肝星状细胞分泌的M2BP可能被库普弗细胞吸收。因此，M2BPGi 不仅可用作预测肝纤维化的血清生物标志物，而且还可能通过肝组织细胞外基质的炎症在纤维化的进展中发挥重要作用[15]。

除了评估慢性肝病的纤维化外，血清M2BPGi水平与HBV感染导致HCC发展的风险显著相关。Jun等人报道，M2BPGi在预测CHB患者发生HCC方面比AFP更有效[16]。在接受NAs治疗的CHB患者和检测不到HBV DNA的病例中，治疗前M2BPGi水平高的患者发生HCC的风险增加[17]。

5 其他生物标志物

上面讨论的血液生物标志物的评估已经在科学界达成共识。下面简要描述一些有望在未来被开发为HBV相关肝癌的有希望的血液生物标志物的候选物。

5.1 WFA+-CSF1R 通过对慢性丙型肝炎和肝硬化患者血清的分析，确定了肝癌的另一个聚糖标记物WFA+集落刺激因子1受体(Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)。CSR1R是一种膜蛋白，其功能与巨噬细胞分化和细胞增殖有关。据报道，肿瘤组织中CSF1R的表达与乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的不良预后相关。对慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清的分析表明，WFA+-CSF1R可能有助于预测肝癌发生和肝硬化的预后[18]。

5.2 细胞外囊泡 细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由脂质双分子层分隔和糖链覆盖的颗粒，由细胞分泌到体液中。EVs根据其来源、大小和其他特征，可分为外泌体、微囊泡和凋亡囊泡，但有时很难进行严格的区分。外泌体是在内吞过程中形成的囊泡，已知它可以包裹细胞来源的核酸片段，如微小RNA(MicroRNA,miRNA)。外泌体也大量存在于血液中，预计在液体活检中很有价值。Matsuura等人分析了从慢性丙型肝炎患者血浆中提取的EVs，发现miRNA let-7水平与肝纤维化的进展相关[19]。另一项研究表明与健康受试者相比，从HBV和HCV感染患者血浆中获得的miRNAs中miRNA-192和miRNA-122的表达降低[20]。对慢性乙型肝病患者血清的分析表明，CHB和肝硬化的HCC患者EVs中几种miRNAs(miR-21、miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224)的表达显著高于无HCC的CHB和肝硬化患者[21]。

5.3 细胞游离DNA/循环肿瘤 DNA血浆中的细胞游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)大多被认为是来自裂解的造血细胞的DNA，而在癌症患者中，已知部分DNA来源于被免疫系统破坏或凋亡的癌细胞。血液中的细胞外DNA被称为cfDNA，而源自血液中循环的孤立肿瘤细胞的DNA被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)。

Qu等评估了使用HBsAg阳性、无症状个体血液中具有体细胞突变的cfDNA筛查早期 HCC的能力[22]。从血液中提取cfDNA并检测以下基因中至少一个是否存在突变：TP53、TERT、CTNNB1、AXIN1和CTNNB1。此外，HBV整合也被选为检测cfDNA的基因组畸变。在通过血清AFP水平或腹部超声筛查HCC时检测为阴性的患者中，敏感性(cfDNA检测为阳性且腹部增强CT检测到HCC的患者百分比)为100%，特异性为94%。另一项研究表明，血浆总cfDNA水平可作为预测HCC切除后患者HBV相关HCC早期复发的生物标志物[23]。

6 小结

本文中，根据与肿瘤发病机制相关的HBV 基因组特征和细胞糖基化蛋白的分子机制，描述了HBV相关HCC中基于血液的生物标志物的现状。HBcrAg水平反映了HCC的风险，可用于监测HCC的再激活。AFP-L3水平有助于筛选和确定肝癌发生的预后。M2BPGi检测有助于预测肝纤维化和肝癌的发展。所有这些生物标志物都已用于临床实践，并且都提供了可以从患者血液中获得的信息。

新技术(包括糖基化综合分析、细胞外囊泡分析和cfDNA/ctDNA分析)有望作为具有更高敏感性和特异性的候选血液生物标志物在不久的将来得到实际应用。自从1964年Blumberg等人发现HBV作为“澳大利亚抗原”以来，许多研究者的积极研究大大提高了HBV相关HCC的诊断和治疗技术。另一方面，全球HBV感染患者的数量一直在增加，为了减少HBV相关的肝硬化和HCC，需要在基于血液的生物标记物的开发方面取得进一步进展。