厌氧发酵体系中挥发性脂肪酸检测方法研究进展

包 铮 ， 贺 莉*， 李 悦， 宋亚莉

(1.农业农村部沼气科学研究所， 四川 成都 610041; 2.四川省农业援外办公室， 四川 成都 610041)

厌氧发酵(AD)是处理粪便、秸秆、餐厨垃圾等有机废弃物的主要利用方式之一，沼气是AD体系中微生物代谢的产物，它是由有机底物的分解形成的[1-3]。分解过程可分为3个阶段：水解阶段、酸化阶段和产甲烷阶段，在每个阶段都有不同的微生物组参与分解过程[4]。

在厌氧发酵第1阶段，需氧细菌利用酶将大分子有机底物(蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素)转化为分子量较低的化合物(如糖、氨基酸、有机酸和水)，水解细菌分离的酶附着在细菌的外壁上，将底物中的有机成分分解成小的可溶性成分，聚合物被转化为低聚物和单体，这一过程即水解。水解过程依赖于细胞外酶(如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶)，该过程受到4.5～6.0的pH值水平以及罐内时间的影响。在厌氧发酵的第2阶段，产酸菌进行裂解，第1阶段产生的单个分子进入产酸菌的细胞，在那里继续分解，同时，部分厌氧细菌利用氧残基和形成厌氧微生物所需的厌氧条件也参与了该发酵过程。在pH值为6.0～7.5时，该体系主要产生一些挥发性脂肪酸和低分子量醇等物质，如乙酸、乙醇、二氧化碳、硫化氢和氨等，这一过程被称为酸化(或氧化)。同时，该过程会导致pH值的水平降低。在第3阶段，产甲烷菌将乙酸、甲醇等物质转化为甲烷为主的物质，一种方式是利用乙酸产生甲烷，另一种方式是在二氧化碳存在时利用氢气生成甲烷，这个阶段的菌群对温度非常敏感[5]。有机废弃物在厌氧微生物的作用下，经过3个阶段的分解转化后产生甲烷、氢气等气体可被用作清洁能源，挥发性脂肪酸、甲醇、可溶性糖等中间代谢产物可被用作工厂原料，以及最后剩余的沼渣经处理后可以被用作有机肥[6]。AD不仅解决了环境污染的问题还为社会带来了经济效益。

1 VFAs在AD体系中的作用

在整个AD过程中，VFAs是厌氧发酵过程中一类重要的中间代谢产物，正常的AD体系中VFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，其浓度范围比较低且较稳定，约有70%的产甲烷菌都是利用VFAs来进行产甲烷过程。但是一般厌氧发酵体系中有机质的含量较高，在发酵过程中会容易有酸积累的现象发生，即当VFAs浓度在6.7～9.0 mol·m-3时会造成微生物细胞内酸碱平衡失调，进而抑制产甲烷产生，严重影响产甲烷过程的正常进行，当体系中的酸积累现象过于严重时甚至会使细胞失活，直接导致厌氧发酵的失败[7-8]。VFAs的含量变化不仅能够判断AD过程是否顺利进行，而且可以间接观察到AD过程中微生物的活性变化，因此，对其进行实时监测非常必要。

目前，较为传统的VFAs测定方法有比色法和滴定法[9]。这些传统方法存在耗时耗力的缺点，在科技飞速发展的社会，比色法已逐渐淡出研究者们的视野。取而代之的是操作更简便、精度更高的电子仪器设备，例如气相色谱 (GC)法、高效液相色谱法(HPLC)、中红外光谱法(MIRS)、近红外光谱法(NIRS)和生物传感器[10-13]法。

2 AD体系中VFAs检测方法的研究进展

2.1 滴定法

传统滴定法的原理是在碱性条件下通过蒸馏分离出溶液中存在的氨氮，再在酸性环境中收集纯度较高的VFAs，利用碱性溶液进行标定，通过消耗的体积计算VFAs的含量[14]。滴定法成本低、操作简单，但是需要前处理、耗时长、不能在现场使用，在取样和蒸馏过程中可能会损失掉部分VFAs，降低了结果的准确性。此外，有研究发现滴定结果会受厌氧发酵环境中存在各种弱酸根离子以及溶液固体含量等因素的影响，使滴定结果出现误差[15]。为此，许多研究学者通过简化处理步骤、改变溶液环境、选择适当的滴定终点等方法优化改进建立新型滴定法[16]。例如，在分析VFAs与样品离子干扰体系以及总固体之间的关系时，结合GC法和简化滴定步骤后的Nordmann滴定法测得VFAs化学值。滴定过程得到简化，结果差异性也有明显的降低，但是依然需要专门的仪器设备，不利于实际发酵工程中的分析比较[17]。Nativ[18]等人利用模拟溶液开发了一种改进的两点滴定法，VFAs在较高的浓度范围内受到磷酸盐等弱酸离子的影响可以忽略不计。同时，还使用外部分析法，即利用PHRREQC程序通过总无机碳的浓度预测VFAs的变化趋势。此法减少了滴定步骤、提高了结果的精确度，但是操作环境较为严格、对探头灵敏度以及标准样品精度的要求较高。

2.2 GC法

气相色谱仪的原理是样品在进样器中经过高温处理后以气体的形式被载气携带进入毛细色谱柱，各组分在载气的冲洗下由于沸点、吸附系数等不同依次被分离出来，进入检测器后根据给出的信号被记录成不同的色谱峰，通过峰面积和峰高来进行定量和定性分析[19]。GC法所需样品量小、灵敏度较高、适用范围大，VFAs有较强的吸附性且极性较高，加上AD体系较为复杂，含有很多干扰因素，产生的色谱峰容易出现拖尾现象，可以对样品进行预处理(如萃取、酯化)、选择合适的极性柱以及改变GC升温程序等方法来改善此类问题[20-21]。此外，VFAs属于弱酸，具有易挥发的特点，需要对溶液环境进行酸化以确保测定时是分子的状态，同时，在VFAs测定完之后及时清理进样针和色谱柱以避免造成污染和堵塞[22]。Ward[23]等对VFAs的4种监测方法(微气相色谱、薄膜进样质谱、近红外光谱以及pH值)进行中试研究，结果发现薄膜进样质谱需要频繁清洗以及背景测量，不适用于长期测量，除此之外的其他3种方法都具有较高的准确性和低频率维护的优点。Ullah[24]等比较了直接注射和热解吸两种样品运载方式对GC测定性能的影响，发现热解吸方式更好地抑制一些基质反应的发生。

2.3 HPLC法

高效液相色谱技术是一种高效液相色谱仪的分离技术，原理主要是溶液中各组分在两相运动中具有不同的分配系数，导致在反复分配过程中各组分的移动速度具有明显差距，进而被依次分离流出[25]。受固定相的影响可分为固-液吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱以及凝胶色谱[26-27]。Mesquita[28]等使用带有二极管阵列的紫外检测器和离子排斥柱的液相色谱系统对厌氧消化系统中的VFAs进行测定，比较纯溶液和实际发酵溶液的HPLC色谱图发现VFAs的色谱峰的分辨率受溶液环境的干扰程度可以忽略不计，分析检测限、线性、重复性、基质效应等结果表现出7种VFAs都具有良好的独立性以及较高的精确性。Peu[29]等利用配有紫外检测器、自动进样器以及阳离子交换柱的HPLC，在流动相的作用下分离标准溶液和样品中的VFAs，通过分析峰面积之间的关系建立了猪粪中6种VFAs的HPLC测定方法。

2.4 MIRS法

MIRS法是物质的分子结构在中红外光谱区(4000～400 cm-1或者2500～25000 nm)发生基频或倍频吸收产生特征性的吸收峰，从而进行物质的定性或定量分析[30]。经过预处理以及特征光谱提取后的MIRS模型可以有效的监测AD过程，但是复杂的AD体系会使过滤器极易发生堵塞，导致相应的装置不能及时进行监测分析[31]。研究学者通过改进MIRS装置如使用光纤探测器的方法解决类似的问题。Falk[32]等开发了一种基于偏最小二乘法ATR-MIR-FTIR设备，可以实现样品提取、光谱记录以及光谱分析的自动化， 达到了AD体系中6种单组分VFAs的快速定量分析的目标，设备带有的传感系统几乎不需要维修。同时，污泥造成的淤积问题也通过增加转速器搅拌时间得到有效解决。Li[33]等改进采样方式、增加冲洗频率以降低堵塞问题的发生概率，用液相色谱法得到的化学值与中红外光谱建立了基于偏最小二乘法模型，该模型能够测定乙酸、丙酸等单组分的含量，且成功的应用于中试体系中。

2.5 NIRS法

近红外光谱(NIRS)技术是指利用近红外光谱区(12500～4000 cm-1或800～2500 nm)所包含的物质信息进行有机物质的定性或定量的检测技术[34]。NIRS主要有透射式、漫透式和漫反射式3种采集方式，需根据不同待测物或者环境的变化选择合适的采集技术。NIRS模型的效果一般通过相关系数(R2)、均方根误差(RMSE)和残差预测偏差(RPD)3个指标进行评估[35]。越来越多的学者研究NIRS对AD中VFAs等多种参数的监测能力，例如，有研究利用傅里叶变换近红外光谱法结合偏最小二乘法(PLS)建立了污水污泥系统中的挥发性脂肪酸、碳酸氢盐碱度和挥发性固体的回归模型，该模型可用于消化池的原料类型改变和水力保留时间减少的识别和预警，以此来提高污水污泥厌氧消化器的性能[36]。Awhangbo[37]等通过利用NIRS结合多块PLS方法预测不同来源厌氧消化物的VFAs和长链脂肪酸，证实了可以通过多个来源的协同作用来优化监测过程，同时解决了远程探针在厌氧消化中出现的饱和和结垢问题。Stockl[38]等用玉米和青贮牧草进行实验室发酵池的投料，检测AD体系中VFAs、总无机碳(TIC)以及VFAs/ TIC等参数的化学指标，建立并分析了基于PLS的NIRS模型，结果发现经过预处理后的NIRS模型R2分别0.94、0.97和0.85～0.97，RPD值均在3以上，RMSE与所测参数的浓度范围有关，3个指标均说明模型具有较高的精度，但是不适用于浓度高于校准模型浓度的样品。

2.6 生物传感法

生物传感器法结合了生物技术和物理化学技术，将生物活性物质作为传感器的识别元件，其分子识别部分所表达的信号通过转换器转化为电信号，通过这些信号分析待测物质的含量[39]。生物传感器主要包括识别元件、换能器和信号输出装备构成，固定化识别元件是决定传感器性能(例如灵敏性、稳定性、使用寿命等)的核心因素，根据材料的特性一般分为酶传感器、微生物传感器和免疫传感器[40]。研究者们多在识别元件和换能器材料上对其进行机理和功能的深度研究，例如传统的微生物燃料电池(MFC)无法很好地区分AD体系中的有机物质和VFAs，Sun[41]等改进了此类传感器，开发了一种由阳极和阴极组成的两腔室MFC微生物传感器，两腔室之间通过阴离子交换膜(AEM)进行物理分离。通过观察传感器对合成废水中醋酸盐的电流响应，发现电流密度和不同反应时间内乙酸盐浓度呈一种非线性关系，并且在醋酸盐浓度低于40 mM时，电流密度在设计的批次实验结束时间(5 h)达到最大值，对于监测乙酸盐浓度具有一定的可行性。此外，研究结果还发现葡萄糖等非离子物质不能穿过AEM，所以基本不影响传感器的性能，但是AEM会对丙酸盐、丁酸盐和异丁酸盐有一定的选择透过性，对乙酸盐浓度的测定结果造成一定的偏差，同时，较高的初始温度对微生物的活性有很大的影响，而且在长期运行后阴极表面的微生物生长也会影响传感器的性能。此后，该研究团队开发了一种由阳极、阴极和样品室组成的三腔室MFC传感器[42]，此传感器中底物输到阳极室的机理是浓度扩散，醋酸盐通过AEM时受其它离子的干扰导致传质系数和扩散率降低，使得在1 h反应时间得到的结果偏差较大。与之前的研究相比较，监测的浓度范围增大，样品室的添加极大地提高了传感器的稳定性，但是其非线性拟合度较低，制作成本也相对增加。

3 结论与展望

本文总结了6种常用的VFAs测定方法，滴定法成本低、易操作，一般用于总VFAs的测定，对于单个组分的测定来说是很难实现的。GC法是目前相对而言应用最广泛的方法，缺点在于样品测定前需要对其进行消除颗粒、酸化等预处理，使操作步骤变得较为繁琐。HPLC法具有灵敏度高、分离效果好、应用范围广、前处理较为简单等优点，但是其分析成本较为昂贵、分析时间较长。光谱技术由于具有无需预处理、分析速度快、无创、方便、成本低等优点已被广泛应用于农业、石化、医药、食品、聚合物、林业、环境等领域，但是光谱技术受环境的影响(如温度、湿度、样品颗粒大小等)较大，需要结合化学计量学来降低外界因素的干扰。生物传感法兼具生物技术的特异性选择和物理化学技术分析速度快、高灵敏的优点。酶传感器选择性好、灵敏度高，但是其敏感元件提炼工序复杂、造价高、性能不太稳定，微生物传感器相对而言性能更稳定、造价低，且不受AD体系中干扰物质的影响，但是存在响应时间较长、选择性较差的缺点，免疫传感器制作简便、使用寿命长，缺点在于其选择性差、所用的敏感元件材料也不易保存。现在VFAs检测方法的研究趋势正朝着快速、无损、低成本、自动化的方向发展，但是许多方法仍存在仪器性能、检测时间、造价成本等问题，希望未来能够克服这些困难，真正满足实际发酵工程的VFAs自动化在线检测。