免疫检查点抑制剂在EGFR突变型晚期非小细胞肺癌中的应用

郑玉军 姜巍 李晶 代璐璐 陈东妍 李颜君 黄磊 王明吉

流行病学研究[1]发现，2022年中国新发癌症病例482万，癌症死亡321万；肺癌仍是最常见的癌症，也是主要的癌症死亡原因。近十年来，晚期NSCLC的精准治疗，包括靶向治疗、免疫治疗取得了极大的进展，明显延长了患者的无进展生存期（median progression-free survival, mPFS）和总生存期（median overall survival, mOS），并且提高了生活质量。精准治疗的前提是精准诊断，分子分型是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）实施靶向治疗的前提。随着第二代测序技术（next generation sequencing, NGS）的广泛应用，越来越多的驱动基因被发现，目前针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、ROS1、MET、RET、KRAS、HER2和BRAF等靶点的药物已获得相应适应证；但靶向治疗获得较高疗效的同时不可避免地会出现耐药和肿瘤复发[2]。同时，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）彻底改变了III期和IV期NSCLC的治疗格局。KEYNOTE-024研究[3]确立了单药ICIs在程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）表达≥50%患者中的一线治疗地位；PACIFIC研究[4]开启了III期NSCLC放化疗后免疫巩固治疗时代；KEYNOTE-042研究[5]进一步将ICIs单药一线治疗标准扩大至PD-L1表达≥1%；KEYNOTE-189[6]和KEYNOTE-407[7]研究表明无论PD-L1表达水平，ICIs联合化疗均可带来获益。

免疫治疗是否可以为驱动基因阳性NSCLC患者带来获益？目前尚不能将所有驱动基因变异的NSCLC归为一类，不同驱动基因的驱动性、相应靶向药物的疗效、肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）等均有差异；一方面，IMMUNOTARGET研究[8]发现不同驱动基因阳性的晚期NSCLC患者对免疫治疗的响应并不相同，优先靶向还是优先免疫仍存在争议；另一方面，也有研究[9-12]指出，免疫和靶向治疗序贯的顺序、间隔时间与严重不良反应的发生率有关。EGFR突变是NSCLC的一个独特亚型，在全球及我国是最常见的类型，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）具有显著敏感性。因此研究也最广泛，本文就免疫治疗在EGFR突变阳性晚期NSCLC患者中的应用进行综述。

1 EGFR突变晚期NSCLC免疫治疗临床研究

1.1EGFR突变晚期NSCLC免疫单药治疗 Lisberg等[13]的一项II期临床研究应用帕博利珠单抗（Pembrolizumab，200 mg/3 wk，共35个周期）一线未经TKIs治疗的晚期EGFR阳性、PD-L1阳性（≥1%，包括8例PD-L1≥50%）NSCLC患者，主要终点为客观缓解率（objective response rate, ORR）。原计划入组25例患者，在入组了11例后，因缺乏疗效而停止了入组。在这11例患者中，只有1例因标本错误判为EGFR阳性而实际为野生型的患者疗效为部分缓解（partial response, PR），其余10例均未观察到疗效。表明免疫单药不适合EGFR突变晚期NSCLC的一线治疗。因此，在多数的一线ICIs的III期临床研究中均排除了EGFR突变型NSCLC患者，如CheckMate 026[14]（纳武利尤单抗vs化疗）、KEYNOTE-024[2]（帕博利珠单抗vs化疗）、KEYNOTE-042[5]（帕博利珠单抗vs化疗）、Impower 110[15]（阿特珠单抗vs化疗）。

ICIs在后线治疗中的机会如何？2016年美国癌症研究协会（American Association of Cancer Research, AACR）报告了美国麻省总院晚期NSCLC 22例EGFR突变和6例ALK融合型，中位治疗线数为3（0-8），结果显示：EGFR/ALK阳性患者接受ICIs的ORR为3.6%，明显低于EGFR/ALK阴性患者的23.3%[16]。Chee等[17]荟萃分析汇总了CheckMate 017[18]、CheckMate 057[19]、KEYNOTE-010[20]、OAK[21]和POPLAR[22]等5项研究，评价ICIs和多西他赛单药二线治疗晚期非鳞NSCLC患者的疗效，结果显示在总体人群（n=1,903）和EGFR野生型人群（n=1,362）中，ICIs能显著延长OS（P＜0.000,1），但在EGFR突变型（n=186）中，并没有改善OS，差异也无统计学意义（HR=1.05, 95%CI: 0.70-1.55,P＜0.81）。一项II期研究（WJOG8515L）[23]观察纳武利尤单抗（Nivolumab）（n=52）或卡铂-培美曲塞治疗EGFR突变获得性耐药非T790M突变晚期NSCLC的疗效，结果提示Nivolumab组的中位PFS（median PFS, mPFS）和1年PFS概率分别为1.7个月和9.6%，对照组分别为5.6个月和14.0%［P＜001；危险比（hazard ratio, HR）为1.92］。OS分别为20.7个月和19.9个月（HR=0.88, 95%CI: 0.53-1.47），ORR分别为9.6%和36.0%。亚组分析显示，具有高TMB、T细胞炎症基因表达谱得分高、细胞毒性T细胞浸润或其募集相关的基因表达高，Nivolumab获益明显。基于此得出结论，在总体人群中，与卡铂-培美曲塞相比，Nivolumab不会延长PFS。基因表达谱可以鉴定出与Nivolumab疗效相关的TIME。因此，对于EGFR-TKIs治疗失败的NSCLC患者二线治疗，与化疗相比，ICIs单药也并未显示出明显改善生存的优势。ATLANTIC[24]是使用度伐利尤单抗（Durvalumab）单药治疗EGFR/ALK阳性NSCLC患者三线以上的单药前瞻性研究，结果提示PD-L1≥25%的患者mOS为13.3个月；PD-L1≥25%且EGFR阳性患者mOS为16.1个月；12个月OS率为53.3%；24个月OS率为40.7%。

1.2EGFR突变晚期NSCLC免疫联合治疗 免疫治疗联合靶向治疗的一项I期临床研究[25]探索了Nivolumab联合厄洛替尼（Erlotinib）治疗晚期NSCLC患者的效果；共入组21例晚期NSCLC患者，20例EGFR-TKIs耐药，1例初治；研究结果显示，mPFS为5.1个月，mOS为18.7个月；而且整体耐受性可。该结果为一代EGFR-TKIs耐药后患者的治疗提供了新的思路，但由于入组病例数偏少，目前尚无法推广并应用于临床实践。TAヰON[9]研究探索奥希替尼（Ositinib）联合Selumetinib、Savolitinib或Durvalumab治疗EGFR突变晚期NSCLC患者的最佳剂量和安全性。研究中期发现，联合治疗组间质性肺炎的发生率明显升高，因此，认为奥希替尼联合Durvalumab的方案不可行。

ICIs联合化疗是一种潜在的有益策略，2019世界肺癌大会（World Conference on Lung Cancer, WCLC）上发表的一项[26]特瑞普利单抗联合化疗用于EGFR-TKIs治疗失败的EGFR突变阳性T790M阴性晚期NSCLC患者的II期临床研究结果：ORR为54.8%，疾病控制率（disease control rate, DCR）为93.7%，整体人群PFS达7.6个月；3级以上不良事件发生率为51.4%。因此，EGFR突变阳性晚期NSCLC免疫治疗联合化疗尚需要大规模临床研究。

关于免疫联合免疫的治疗模式，KEYNOTE-021[27]试验队列D（剂量发现队列）和H（剂量扩展队列）探讨了在晚期NSCLC的后线治疗中帕博利珠单抗加伊普利单抗（Ipilimumab）的益处，与CheckMate 227[28]一线Nivolumab加Ipilimumab的观察结果相反，免疫联合疗效有限，10例EGFR突变患者中只有1例记录了PR。

尽管PD-1/PD-L1单抗在上述试验中多数以失败告终，那是不是就以为免疫治疗在EGFR突变的患者人群中没有一席之地呢？IMpower150[29]研究验证了以下假设：ICIs联合化疗和抗血管生成药物治疗晚期NSCLC（包括EGFR突变患者）更有效。在对TKIs耐药后的EGFR突变亚组中，与贝伐珠单抗加化疗组相比，在贝伐珠单抗加化疗组中再联合阿替利珠单抗（Atelizumab）可改善ORR，延长PFS和OS（ORR：71%vs42%；mPFS：10.2个月vs6.9个月，HR=0.61；mOS：未达到vs18.7个月，HR=0.61）。有了这些令人鼓舞的结果，ICIs加上抗血管生成药物再加化疗的新组合对于EGFR突变的晚期NSCLC的二线治疗是一种有希望的策略。

总之，ICIs单药作为EGFR突变晚期NSCLC的后线治疗效果有限。联合治疗包括ICIs联合化疗，尤其是Atelizumab+贝伐珠单抗+卡铂+紫杉醇的四重疗法，疗效显著；但由于不良事件发生率高，在应用时需要特别小心。

另外，需要注意ICIs与TKIs序贯治疗的顺序，近来不断有研究指出，ICIs序贯TKIs可能导致严重不良反应。一项回顾性研究[10]分析了ICIs序贯Ositinib的安全性，结果显示，15%（6/41）的患者发生了严重的免疫相关不良反应（immune related adverse reactions, irAE）。并且，严重irAE的发生率与ICIs和TKIs的间隔时间有关，分别为24%（5/21）（距最后一剂ICIs＜3个月）、13%（1/8）（3个月-12个月）和0%（0/12）（＞12个月）。然而，在Ositinib序贯ICIs或ICIs序贯其他EGFR-TKIs时并未发现严重irAE。

2 EGFR阳性晚期NSCLC免疫特征

目前，EGFR突变NSCLC患者ICIs效果不佳的机制认为，相比EGFR野生型，EGFR突变的NSCLC肿瘤特点是免疫惰性表型，具有低PD-L1表达、低肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）和低肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）。此外，单细胞分析显示，EGFR-TKIs无论是原发性还是继发性耐药肿瘤，CD73表达均上调。EGFR信号通路和EGFR-TKIs在许多方面都影响免疫疗效。

2.1EGFR突变型NSCLC中PD-L1表达 一项包含3,283例患者的荟萃分析[30]显示，EGFR突变型NSCLC比野生型PD-L1表达更低，为了证实这项荟萃分析的结果，研究者分析了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和国内广东肺癌研究所（Guangdong Lung Cancer Institute, GLCI）数据库中PD-L1的蛋白质和mRNA图谱。相比于EGFR野生型，mRNA图谱显示EGFR突变NSCLC中PD-L1及TILs均低表达；免疫组化显示T细胞浸润程度亦低。联合分析发现EGFR突变组的双阳性（PD-L1+/CD8+TIL）比例明显减少，而双阴性（PD-L1-/CD8-TIL）比例增加。同时，用85例肺腺癌的全基因组测序进行样本验证，发现EGFR突变阳性NSCLC患者的TMB较野生型低。

PD-L1作为一种免疫检查点蛋白，在肿瘤细胞和TILs中均有表达[31]。PD-L1的表达受两种不同机制的影响：内在表达和获得性表达。内在表达方式是通过EGFR突变激活下游信号通路从而上调肿瘤细胞中PD-L1的表达，如丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶/c-Jun（MAPK/ERK/c-Jun）、Hippo/Yes相关蛋白（Hippo/YAP）和Janus激酶/信号转导子和转录激活子3（JAK/STAT3）信号通路[32-34]。相反，体外研究[35]表明，EGFR通路激活可以抑制γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）活性从而抑制获得性PD-L1表达。

研究结果的差异性可能与多种因素有关，如不同的PD-L1检测技术（不同的抗体、检测平台和不同的阳性阈值）、肿瘤异质性和肿瘤组织来源（如细胞学标本、存档标本、新鲜标本、原发和转移部位）。

2.2EGFR突变型NSCLC的TMB TMB被定义为整个肿瘤基因组中体细胞突变总数，是预测ICIs疗效的新兴生物标志物。与EGFR耐药/未知组相比，EGFR敏感性突变（根据对第一代EGFR-TKIs的反应定义）的TMB显著降低。Haratani等[36]评估Nivolumab对于EGFR突变的NSCLC患者的疗效，TMB中位数为101，对Nivolumab有显著反应的患者的TMB显著高于无反应的患者。此外，Dong等[30]发现，与EGFR野生型组相比，EGFR突变组（外显子19 Del、L858R、L861Q、G719X和S768I）的TMB中位数显著降低（56vs181）。TMB降低可能是EGFR突变患者对ICIs反应不佳的机制[30,37,38]。然而，TMB的检测、计算方法和阈值尚无统一标准。进一步确定TMB作为ICIs生物标志物可能有助于选择合适的人群。

2.3EGFR突变型NSCLC的TIME TIME是肿瘤生长发育的内部环境，有研究已经报道，EGFR突变可以调节TIME状态，从而影响抗肿瘤免疫反应，包括TILs、Tregs、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage, TAM）、免疫调节细胞因子和外泌体。

TILs是一组存在于肿瘤巢和间质中的肿瘤浸润性和抗原细胞群。在TIME的发生发展过程中充当抗肿瘤免疫细胞，通过释放IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B等细胞因子破坏肿瘤细胞；TILs的数量决定了抗肿瘤的杀伤效率。CXC趋化因子配体10（CXC chemokine ligand 10, CXCL10）可以通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）信号通路招募效应CD8+T细胞[39,40]。EGFR通路激活下调CXCL10，从而抑制效应CD8+T细胞的募集[41]。因此，EGFR突变的肿瘤通常表现为CD8+TILs浸润较低[31,42]，导致免疫缺陷和不良预后[36]。Toki等[43]利用荧光技术探索了EGFR突变与TILs状态之间的关系中发现，EGFR突变组的患者中检测到衰竭或休眠免疫的状态（高CD3、低Ki67和低颗粒酶B），PD-L1高表达的肿瘤细胞和基质细胞具有高度浸润的活化TILs（分别为P=0.001,4和P=0.02）。此外发现，不同EGFR突变位点免疫学特征存在差异：EGFRL858R样本中CD8+T细胞的表达显著高于EGFR外显子19缺失，但肿瘤细胞和基质细胞中PD-L1表达两者无差异[43,44]。

Tregs被认为是抗肿瘤免疫的一个关键障碍，Treg在EGFR突变的肿瘤中高度浸润[45]，通过分泌白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、IL-35和转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF-β），减弱自然杀伤（natural killer, NK）细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应[46]。临床前研究[47]观察到EGFR突变可以通过JNK-C-Jun途径上调C-C类趋化因子（C-C class chemokines 22, CCL22），从而上调Treg相关基因的表达，并招募Treg细胞。Wang等[48]发现，EGFR/糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK-3）/叉头盒蛋白3（forkhead box protein p3, Foxp3）轴通过双调蛋白（amphiregulin, AREG）介导Treg的免疫抑制功能，促进肿瘤进展。双调蛋白是EGFR配体之一，能够促进肿瘤进展[49]。此外，Huang等[50]发现含有EGFR的外泌体促进树突状细胞（dendritic cell, DC）分泌吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO），进而促进CD3+CD4+CD25+T细胞向Treg的转化。

其他影响TIME的因素还有主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC），其在抗原提呈中起重要作用。有研究[51-53]表明，MHC-I和MHC-II的表达通过IFN-γ信号通路和下游MEK/ERK信号通路下调。另外，EGFR突变的肿瘤细胞可能上调CD73[44]。CD73是多种肿瘤和免疫细胞表达的负性免疫调节因子，它可将三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）转化为腺苷（adenosine, ADO），ADO与免疫细胞上的ADO受体结合，上调Treg的表达，介导肿瘤细胞的转移和增殖。丰富的ADO对多种免疫细胞具有免疫抑制活性。它促进Treg的激活和髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）的积累，进一步减弱效应T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞和DC的抗肿瘤功能，使巨噬细胞（macrophages, Mφ）极化向M2倾斜，并抑制Teff介导的抗肿瘤反应，介导肿瘤免疫逃逸。体外实验[53]中，EGF诱导CD73表达，EGFRTKIs抑制CD73表达。这些发现表明，异常的EGFR信号增加了CD73的表达，并且CD73-ADO轴是EGFR突变肿瘤中的另一种可能的免疫抑制机制。Le等[54]证明，EGFR突变型肺癌的小鼠模型中，阻断CD73-ADO轴可显著抑制肿瘤进展。

2.4 EGFR-TKIs对肿瘤免疫微环境的影响 抗EGFR治疗可改变TME，理论上及体外细胞系实验表明，EGFR-TKIs通过抑制EGFR信号下调PD-L1的表达[55]。然而，一些临床分析[56,57]发现，经EGFR-TKIs治疗后，PD-L1表达呈上升趋势且PD-L1高表达的患者比低表达的患者有更长的OS（7.1个月vs1.7个月，P=0.003,3）。Justin等[16]也证明，EGFR-TKIs耐药后，21%的患者肿瘤组织中PD-L1表达增加。一项血液分析[58]也发现EGFR-TKIs治疗1周后，血液中的PD-L1+T细胞显著增加。EGFR-TKIs原发性耐药的患者表现出肿瘤细胞PD-L1表达和PD-L1+CD8+T细胞浸润[59,60]。研究[34,46,61]发现EGFR-TKIs可以减轻EGFR信号对T细胞的抑制，削弱Treg细胞的功能，增强IFN-γ的产生，并增强MHC-I和MHC-II的表达。小鼠模型中，Brea等[62]证明了EGFR-TKIs的动态效应，他们观察到EGFR-TKIs对TIME的影响在早期是有益的，但在后期是免疫抑制的。在早期，CD8+T细胞、DC和M1样肿瘤相关巨噬细胞（tumor associate macrophage, TAM）的数量呈增加趋势，而Treg浸润减少。EGFR-TKIs治疗的后期，IL-10和CCL2分泌增加促进了骨髓间充质干细胞的迁移和激活，从而抑制免疫，促进血管生成和转移[47,61]。短期低剂量Erlotinib导致EGFR突变肿瘤的免疫介导细胞毒性以及NK细胞和抗原特异性T细胞的肿瘤溶解。然而，在长期使用Erlotinib后，这种增强的免疫介导的细胞毒性消失了[61]。上述研究为在Erlotinib耐药之前给予ICIs和Erlotinib联合治疗提供了理论依据。

3 EGFR基因突变位点与ICIs的有效性

一项研究[63]发现，在600例EGFR突变的NSCLC患者中，49例（8.2%）罕见突变（G719X、L861Q、S768I和Ex20-ins），PD-L1+者占49.0%（24/49），敏感突变（19del和L858R）患者为12.2%（67/551）（P＜0.05）。PD-L1+与相对较短的OS相关（15.2个月vs29.3个月，P=0.006），此外，PD-L1+主要见于CD8+TILs浸润的肿瘤（P=0.001）。EGFR罕见突变同时PD-L1+和CD8+T细胞浸润的患者占36.7%，双阳性组的预后最差（P=0.023）。值得注意的是，PD-L1+和CD8+T细胞双阳性的患者对ICIs疗效好。因此得出结论：罕见EGFR突变的NSCLC患者伴随PD-L1+和CD8+TILs的比率高。另一项研究[39]发现，EGFRT790M阴性和T790M阳性患者的PFS分别为2.1个月和1.3个月（P=0.099, HR=0.48, 95%CI: 0.20-1.24）。PD-L1表达水平≥1%和＜1%患者的mPFS分别为2.1个月和1.3个月（P=0.084, HR=0.37, 95%CI: 0.10-1.21）。PFS随着PD-L1表达水平的增加而增加，域值分别为≥10%和≥50%。在T790M阴性患者中，PD-L1高表达的比例高于T790M阳性患者。免疫治疗应答者的CD8+TILs密度和非同义突变负荷显著较高。在EGFRTKIs治疗后，EGFR突变阳性且T790M阴性NSCLC患者更可能受益于免疫治疗，这可能是因为PD-L1表达水平高于T790M阳性患者。

4 小结

免疫治疗并不适合作为EGFR突变的NSCLC患者的一线治疗。PD-L1的低表达、TMB的低水平以及免疫抑制环境的上调是EGFR突变NSCLC患者ICIs治疗处于劣势的原因。不同EGFR突变亚型（外显子19vs外显子21vs少见突变vsT790M）TIME的特征不同。对于EGFR-TKIs治疗失败的患者，与化疗相比，免疫单药治疗并未显示出明显改善生存的优势。EGFR-TKIs对TIME的影响是动态的。EGFR-TKIs与ICIs联合应用不仅没有提高疗效，反而增加了毒性。然而，免疫治疗和化疗的结合显示了初步的疗效，抗血管治疗也能改变免疫微环境，IMpower150[29]中ICIs联合化疗和抗血管生成药物显示了良好的生存益处。及时动态监测，选择合适的时间窗，可以扩大适合免疫治疗的人群。总体而言，联合治疗可能更适合EGFR突变阳性TKIs耐药后晚期NSCLC的患者。驱动基因阳性肺癌免疫治疗的未来是优化人群、选择时机和方案。