鞋类抗真菌定性试验方法（生长法）技术解析——基于ISO19574国际标准的制定和国际比对试验

张伟娟，畅文凯，郑苏江

（1.北京服装学院，北京100029；2.中轻检验认证有限公司，北京100015；3.中国科学院理化技术研究所，北京100190）

引言

我国每年生产100多亿双的鞋类产品,一半以上出口到欧洲、美洲、非洲等众多国家，尤其在海上长途运输过程中，鞋类产品长期处于高温和高湿环境，如果防霉措施处理不当，会引发产品霉变，造成退货、索赔等严重损失。即便在国内运输，由于我国幅员辽阔，从生产基地到消费者手中，也会经历较长时间的运输和贮存，鞋厂仍然不可忽视产品的防霉处理[1]。生产企业利用防霉技术处理鞋子有两种方法，一种是仅处理鞋子的储存环境（如鞋盒内部），使之霉菌处于较低水平，达到储存期限内鞋子不霉变的目的；另一种是处理鞋子内腔，在正常使用条件下，鞋内部的霉菌或真菌可不大量滋生繁殖，保护使用者并提升舒适度。本测试方法研究涉及到的是后一种。

相对于穿着与身体上的服装,鞋的密闭性最大，加之足部是人体汗腺高度集中的部位，排汗量很大，鞋腔非常容易形成高湿度、高温度和黑暗的环境，这也是由真菌引发的足部疾病如甲真菌病、足癣等成为皮肤科常见的多发病的原因之一[2]。随着消费者对健康问题的日益关注，具有抗真菌功能的鞋类产品逐渐发展起来。抗真菌鞋类产品旨在抵抗真菌的生长或降低其影响。

抗真菌性能是抗真菌材料、部件或产品的重要指标，试验方法标准是客观反映抗真菌性的关键。目前在用的抗真菌（霉菌）测试方法主要包括定量法和定性方法；定量法如广东省微生物研究所进行了光催化材料及制品的抗真菌性能测试方法的研究，解决了测试中的光照强度对真菌孢子的影响[3]，最终成果制定了国家标准GB/T 37247-2018光催化材料及制品抗真菌性能测试方法及评价。罗利玲等[4]对抗菌纺织品测试标准进行分析和总结，涉及到织物的抗真菌定量方法和定性方法，仅针对白色念珠菌，没有涉及到霉菌。谢小保等[5]对织物抗菌防霉检测技术进行了总结和研究，指出现在的定性和定量测试方法有多种，材料选择不同方法得到的结果可能会不同，方法间不能简单比较。

由于定性分析方法能较为直观的观察和评估材料的抗真菌性能，目前，仍有很多用户倾向于基于生长测试法这一传统测试方法定性测定抗真菌性能。但由于没有专门的鞋类抗真菌定性评估的标准，在本国际标准出台前，鞋类产品在进行抗真菌检测时，需要把不同材料分开，按照不同的标准进行测试，十分耗时耗力。因材料的不同而选择不同方法试验，这也导致一双鞋可能会有多个试验结果，对鞋类产品的抗真菌检测和结果评判造成诸多不便，影响到鞋类抗菌产品市场健康有序的发展。因此确定针对鞋类产品的统一抗真菌评估试验验方法的国际标准是非常有必要和有意义的。我国基于对鞋类和鞋类部件抗真菌定性评估试验方法的前期理论以及多年检测实践经验以及行业需求，在国际层面上提出制定相关标准，立项成功后，主持了该标准的制定。本国际标准（ISO 19574）重点对鞋类和鞋类部件的抗真菌性能定性评价过程中菌种的选取、菌液的制备，培养基及结果评定等重要步骤进行了探讨研究，同时还对制定的定性试验方法组织了试验验证（国际比对），使抗真菌性能评估试验方法更加规范，试验结果与产品使用效果相关性更加密切。由于该标准是作为国际标准发布，因此其可在全球制鞋业推广使用。

1 鞋类原材料分析及相关抗真菌测试评估方法标准

随着材料的发展，鞋材也日益多样，从种类上可分为天然材料和合成材料两大类。天然材料有植物纤维如棉、麻等；动物毛皮如猪皮革、牛皮革、马皮革、羊皮革等。人工合成材料包括化纤、混纺布，橡胶材料，塑料材料，人造革，海绵等[1]。在ISO 20150[6]和ISO 19574[7]发布之前，对于鞋类的抗真菌测试评估方法由于鞋材的不同而分散在不同的标准之中，其中抗真菌定性测试评估见表1，给鞋类产品的检测造成了非常大的困扰和不便，这也是ISO 19574开展研制的主要原因。

由表1可看出，目前抗真菌的定性测试方法一般采用：材料与真菌（主要是霉菌）在一定温度、湿度条件下，共同接触培养一段时间，最终以材料表面或接触面的霉菌生长情况来判定材料对抗真菌的性能。

表1 不同材质抗真菌定性评估方法汇总Tab.1 Main qualitative test methods of antifungal activity of different materials

2 关键试验步骤的研制和分析

2.1 菌种的选择

对鞋类抗真菌定性测试，选择菌株种类时要考虑到鞋类材质、鞋类穿着特点、足部真菌特征以及市场实际需求，在选择代表性菌种时需具有代表性和可操作性，同时符合市场需求对该测试方法的预期。

鞋类在生产和储存、运输中，主要易受环境空气中微生物/真菌影响，发生发霉，长毛，颜色外观发生改变等现象，这类真菌主要以曲霉属和青霉属来代表；鞋类在穿着使用过程中，可能因真菌繁殖带来脚部疾病，如真菌感染，这类真菌可采用癣菌属来代表；所以在菌种选择时，要考虑到皮肤癣菌和非皮肤癣菌的代表性菌种的选择。

ISO 19574基于世界上主要的国家如中国、德国、西班牙、法国、英国、南非等国家对于菌种类型的综合考量，无论从鞋类产品的实际储运、穿用环境，还是从抗菌性能的评估方面，最终形成了世界范围内的测试菌种，具体菌种的选择见表2。

表2 鞋类抗真菌定性测试评估方法中菌种的选择Tab.2 Test strains for the footwear qualitative test methods of antifungal activity of footwear

2.2 选择单一菌种或菌种混合悬浮液的试验指导

为了使测试方法更加灵活地适应客户对测试需求，如客户通常要求仅对黑曲霉具有抗真菌活性，可以选择黑曲霉单一菌种进行测试；如产品声称对霉菌具有抗真菌特性，则可以在黑曲霉和绳状青霉中选一种进行试验，既可以作为混合悬浮液，也可以单独进行；如果是混合悬浮液，则应分别测试一种黑曲霉属和绳状青霉菌的混合悬浮液或一种巴西曲霉属和绳状青霉菌的混合悬浮液。如果声称对皮肤癣菌具有抗真菌特性，则应测试须毛癣菌。

即使如此，因为在试验中发现曲霉菌的生长和孢子形成速度都更快，因此采用混合霉菌测试时，总是会对绳状青霉产生一定的扭曲。因此还是最好独立测试每种测试菌种。

另外由于霉菌的生长速度远快于皮肤癣菌株，所以在菌种混合上，明确规定了不能对霉菌株和皮肤癣菌株的混合悬浮液进行测定。

目前国内标准如GB/T 23164、GB/T 24128、QB/T 4199、QB/T 4341为混合霉菌测试，国外标准如ISO 16869、ASTM G21均 为 混 合 霉 测 试，ISO 846、ASTM D 4576、AATCC30为单种霉测试，ISO 19574与上述国内标准和国际标准以及国外标准不同，既可以测试单一菌种，又可以测试混合菌种，这样即满足了客户的特定需求即可取单一菌种进行试验；又满足了对两种霉菌的同时考核，标准规定了混合悬浮液的制备；同时又满足了鞋类/足部不同真菌的测定，即标准对鞋类抗真菌试验中真菌的霉菌和皮肤癣菌做了有效的区分。

由于微生物的自然需求，对pH值进行了规定，其应处在中性范围内，只有缓冲液可将pH值保持在中性范围内。

2.3 培养基和接触培养时间

塑料、非天然织物材料在使用过程中更可能出现低营养低有机负荷的区域，矿物盐介质通常是首选的，而鞋子的使用过程中总会有大量的营养物质可用（皮肤脱落物皮屑、有机油脂、汗液、颗粒物、细菌等等），因此在测定鞋类材料的抗真菌特性时，国际标准ISO 19574中使用完整的营养培养基（如麦芽或马铃薯葡萄糖）培养来接种的试样，与鞋类实际穿着场景相一致，测试结果更加有意义。

此外，如果必要，可以将接触培养周期从4周（通常培养周期）减少到2周。这将帮助所有面临时间压力的客户。培养周期的减少对于结果来说是有偏离，具体来说材料对真菌的抑制过程中，初期是真菌受抑制，随着时间的推移、培养基上抗真菌剂的消耗、菌株的繁殖等因素影响，后期（较长接触时间，＞2周）的结果一般是劣化的。

2.4 结果评定

定性分析法亦称非数量分析法，是一种较为主观的分析方法，主要依靠操作人员的丰富实践经验以及主观的判断和分析能力，对于鞋类抗真菌定性测试评估结果，因为菌种生长面积不规则，所以至少采用3个平行样的方式判定，结合菌株活性的有效性判定，可以确保试验结果的重现性和重复性。

3 测试方法的应用实践

对鞋类抗真菌的定性评估试验方法分析，制定标准草稿后，为评价本定性方法在实际中是否能有效的评估抗真菌鞋材，设计一组试验来验证。

在评估结果时为了减少主观性带来的结果不确定性，为了获得对试验结果的一致性评估，为了更好的在实验室间获得满意的结果重现性，统一选用黑曲霉（ATCCR6275TM）作为试验菌种和试验样品，遵循相同的操作步骤，对反馈的试验结果进行分析。

3.1 样品制备

选择密织布来作为验证试验的原材料，作为空白样，添加一定的抗菌剂的抗菌样品，分别为样品B、样品M和样品H。样品制备见表3。

表3 试验样品的制备Tab.3 Preparation of test specimens

3种试验样品制备完成后，分发至西班牙、德国、葡萄牙、英国和中国等5个国家9个实验室进行比对试验，依据常规的霉菌评价方法，采用样品表面的长霉面积占样品总接触面的比例来确定霉菌生长级别，0级（20倍放大下，不长）、1级（显微镜下可见）、2级（至10%）、3级（至60%）和4级（＞60%），试验结果见图1。

图1 试验结果汇总（按级数）Fig.1 The evaluation of test results(according to evaluation scheme)

从试验结果可以看出，对于样品B，各家实验室结果都一致为4级，测试菌种生长覆盖面积超过了试样的60%。对于样品M，各家实验室结果基本一致，除一家为3级外，其余均为4级。对于样品H，各家实验室结果总体趋势一致，有两家结果为2级，1家结果为4级（经该实验室复核，该样品有误或受到污染），其余2/3的实验室均为0级（显微镜下不长）。

虽然B和M最终结果评级均为4级，但真菌的生长面积在相同时间内B的面积要普遍高于M，这也验证了M较B而言，具有一定的抗真菌能力，这与样品制备的抗真菌性能相一致，见图2。

图2 试验结果汇总（按生长面积）Fig.2 The evaluation of test results(according to growth area)

在分析实验室操作步骤，总结偏离原因，根据最后的有效结果，各实验室一致认为该试验结果验证了样品的抗真菌性能一致性，同时通过试验也对试验结果的评估提供了改进，见表4。

表4 鞋类抗真菌定性测试评估Tab.4 Evaluation scheme of micro-fungi growth

3.2 孢子的代数及活性

本试验是进行样品和孢子共培养28天，来判定结果，所以孢子活性就是本试验的关键控制因素。各家采用的孢子代数从1代到4代，符合方法要求的4代以内，活性有保证。

记录观察到的生长是否是由于菌丝体形成分生孢子或不形成分生孢子，即产孢，可能会有所帮助。在任何情况下，在进行评估时，应考虑所有类型的生长，而不考虑是否存在孢子形成。

3.3 网格的应用

本国际试验方法标准为定性试验，其误差控制比定量试验有着显著不同。通过此次国际比对试验发现，没有其他参照物时，判定人员的主观意识和经验十分重要。为了提高评估面积的准确性，减少误差，建议在试验结果评判时，采用叠加网格线的方法进行面积评估，试验示例见图3～图5。

图3 叠加网格线进行真菌生长评估-4级Fig.3 Grid for the evaluation of fungal growth level 4

图5 叠加网格线进行真菌生长评估-0级Fig.5 Grid for the evaluation of fungal growth level 0

3.4 试验结果照片的澄清

由于抗真菌试验的接触培养周期较长，动辄28天，一旦出问题复盘时需查阅各阶段证据，所以保留各阶段培养的结果照片非常重要。

结果照片也可用于判定级别时，评价不同判定人员间的人员比对，保证做到依据同样的判定标准判定同一培养结果（照片）时，可以得到相同的结果。

当然，如果客户需要，本结果照片也可作为直接证据提供给客户，或者作为数据出现在结果报告中。

4 ISO 19574技术解析

（1）本方法的主要误差来源是菌种的活性。菌种活性作为刻度尺，来衡量样品的结果。因此菌种活性控制对本试验有效性成立至关重要。为了控制菌种活性，要求试验统一菌种、统一菌种编号，其传代代数控制在4代以内，确保菌种活性不至于发生较大的变化，以此来确保“刻度尺”的刻度不变。

图4 叠加网格线进行真菌生长评估-2级Fig.4 Grid for the evaluation of fungal growth level 2

（2）培养条件对结果的影响。本试验要求最长28天的培养，如此长的时间范围内，培养环境的影响相当重要。所以本方法中规定了培养环境的温度和相对湿度范围，做到精准控制。湿度降低，孢子由于逐渐失水而丧失活性，导致结果偏差大。温度升高或降低，都对孢子的生长有影响。

（3）培养时间的影响。一般来讲培养时间缩短，孢子生长需要时间，所以长霉面积会减少；随着培养时间的延长，培养基表面和样品表面的长霉面积均增加明显。所以结果报告上需注明接触培养时间。对相同的样品不同的培养时间，其结果不能直接比较。

（4）通过定期对试验结果的观察，发现在试验期间内一旦有超10%的样本表面有真菌生长，霉菌侵扰只是时间问题，所以在评级时，对不到10%的生长率，且肉眼看不到孢子形成，则可归类为材料具有一定的抗真菌生长能力，抗真菌性能定级为1。如果有10%或以上，则归类为对真菌生长的抵抗力有限。在接下来的分类中，则以60%的生长率为界，如果是60%以下，材料对真菌生长的抵抗力可忽略不计，而60%以上，则可认为该材料对真菌生长没有抵抗力。在判断无生长时，必须要用20倍以上，最好是50倍的显微镜进行确认。

（5）结果判定上，利用网格卡片来判定长霉面积，减少主观判定，也是减少误差的重要方式。

本方法通过抗真菌定性试验方法的关键步骤的研制和分析，并通过国际比对试验验证了该方法复现性，可操作性也非常强，在全球范围内都具有普遍适用性。本方法解决了行业对鞋类产品的抗真菌定性评估试验方法的需求，满足了客户快速直观观察结果的需求，试验条件近似实际商品的使用环境，结果对使用有重要的参考价值。

国际标准ISO 19574《鞋类产品抗真菌定性评估试验方法》科学、合理，其汇集了中国、欧盟等多个国家抗菌专家的经验和智慧。该国际标准对其他相关产品也有参考意义，ISO 19574与我国主持制定的ISO 16187和ISO 20150一起初步建立了鞋类微生物领域的标准体系。