琼脂覆盖法防止菌落蔓延生长的可行性探究

田 霞，王春林，余 为，刘琪雯

（重庆市黔江食品药品检验所，重庆 409003）

菌数总数作为食品微生物学检测的基础项目，对食品安全起着至关重要的作用。菌落总数可以用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价[1]。如果食品菌落总数超标，说明该食品的卫生质量达不到基本的卫生要求，因为大量的细菌能够破坏食品中的营养成分，加速食品的腐败变质。随着食品工业的发展，食品种类更加丰富，生产原料品种来源更广泛，加工工艺也更复杂，但微生物的污染仍然无法避免，尤其是糕点、面点等含高淀粉类食品受芽孢杆菌污染的概率大[2-5]，产品加工过程中灭菌不彻底，菌落计数时平板上容易出现菌落弥漫生长的现象，导致菌落无法计数，对菌落总数检验项目的准确性造成严重的影响[6]。本文采用琼脂覆盖法，即在样品和培养基混匀凝固后，再在其表面加盖一薄层（约4 mL）平板计数琼脂培养基，通过对比不覆盖检验方法，对覆盖法的有效性进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

月饼：重庆渝东南片区（黔江、彭水、酉阳、秀山）市售月饼50批，其中广式月饼47批，滇式月饼2批，台式月饼1批。

培养基：磷酸盐缓冲液（201108），购自北京陆桥技术有限责任公司；平板计数琼脂培养基（211201），购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9162电热恒温培养箱，上海和呈仪器制造有限公司；HH.B11-500-BS-Ⅱ 电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；LDZM-80KCS-III立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基及样品制备

按照国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）进行检测，无菌称取样品25 g加入225 mL的无菌磷酸盐缓冲液中，即得到1∶10的稀释样品匀液，再无菌吸取1∶10样品匀液1 mL加入9 mL无菌磷酸盐缓冲液中，即得到1∶100的稀释样品匀液，依次制备10倍系列稀释样品匀液1∶1 000、1∶10 000。每次递增一个稀释度，更换1 mL无菌的刻度吸管，估计样品的污染状况程度，选择3个连续的稀释度，每个稀释度覆盖组做2个平板，不覆盖组做2个平板。同时做空白对照组，即吸取无菌稀释液1 mL至无菌平皿内，做两个平板。提前制备好平板计数培养基，放置于48℃±2℃恒温箱中保温，及时倾注转动平皿，使样品匀液与培养基充分混匀，覆盖组在培养基凝固后再均匀倾盖约4 mL培养基。在短时间内完成样品的取样、稀释以及平板制备。

1.3.2 菌落培养及结果观察

所有平板均倒置放于电热恒温培养箱中36 ℃培养48 h，观察结果并进行计数，记录对应的稀释倍数与菌落数量。菌落结果选取个数在30～300 CFU、无蔓延生长情况的平板计数，个数小于30的平板则记下具体菌落个数，个数大于300的平板记结果为多不可计；若出现较大片状菌落生长的平板时，则不能采用，以另一个无片状生长的平板的菌落个数作为此稀释度的菌落数；若菌落蔓延的生长未占到一半的平板，而剩下的一半平板菌落又很均匀地分布，则可以用均匀分布的半个平板的菌落数乘以2，作为这一个平板的菌落总个数。菌落总数结果以稀释度平均数乘以稀释倍数表示，即每克中菌落总数个数（CFU·g-1）。

1.3.3 实验设置

（1）不加覆盖组。按照国家标准检测，制成检验培养基平板后培养基不加覆盖。

（2）加覆盖组。按照国家标准检测，制成检验培养基平板后，再在其表面加入一薄层平板计数琼脂培养基（约4 mL），即加覆盖。

（3）空白对照组。按照国家标准检测，覆盖和不覆盖均做两个平板。覆盖组和不覆盖组生长结果均为无菌生长，则此次试验有效。

2 结果与分析

计数每个样品各个稀释度、两个组的检验平板的菌落蔓延情况，再计数不蔓延检验平板的菌落数量。空白对照组平板均无菌落生长。50批月饼样品均为热加工工艺，两组均有5批月饼菌落总数小于10 CFU·g-1，1批月饼菌落总数值110 000，大于《食品安全国家标准 糕点、面包》最高安全限量（M=100 000 CFU·g-1），产品菌落总数项目不符合国家限量标准，即不合格。检验平板蔓延均出现在1∶10稀释度，蔓延生长的月饼样品地方派式有广式和滇式，此次覆盖组与不覆盖组的菌落总数检测结果中位值均为150，50批样品基本信息及菌落总数检测结果情况见表1。统计50批月饼样品覆盖与不覆盖组菌落蔓延情况，见表2。

表1 50批样品基本信息及菌落总数检测结果情况表

表2 50批月饼样品覆盖与不覆盖组菌落蔓延情况统计表

从表2中可以看出覆盖组和不覆盖组两种检验方法有显著性差异，不覆盖组出现菌落蔓延情况比较严重，蔓延平板占比34%，覆盖组能很大程度控制菌落蔓延生长，蔓延平板占比降低为12%。蔓延生长的平板在菌落结果计数有时不宜采用，有时以平板的一半菌落数乘以2计数，极大地影响了菌落总数的准确计数。虽然实际应用中依然有个别平板蔓延生长的情况出现，但总体而言，覆盖法能有效改善平菌落蔓延生长问题，研究人员在实际工作中可以适当采用。

3 结论与讨论

月饼作为我国特有的传统焙烤食品，其因含有丰富的营养物质在生产和储存期间极易受微生物污染而腐败变质。菌落总数作为食品检测基础性指标，一定程度上能反映月饼的食品卫生质量情况。从近年来市售月饼质量抽查结果中可以看出，菌落总数是月饼质量的主要安全问题之一[7]，且市售月饼的菌落总数项目合格率很难大幅度提高[8]。市场上消费较多的广式月饼含有的优势细菌是芽孢杆菌和球菌[9]，而芽孢杆菌极易引起菌落总数测定时蔓延生长，影响菌落总数结果的准确计数。有研究指出可以在琼脂中加入0.2%～0.3%的TTC防止菌落出现弥漫现象[10]。也有研究发现检验平板做好后再在其表面覆盖5 mL琼脂质量分数为2.0%的培养基（配方：琼脂20 g，水980 g），比在培养皿皿盖中放置两层滤纸的方法和每100 mLPCA培养基中加入2.5 mL 0.1%TTC溶液混匀的方法更能降低菌落蔓延对检验结果的影响[11]。国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）即将实施，相较于2016年版，其菌落总数结果报告中删除了“若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延”这一项情况，这要求检验员更为准确地预判样品中是否含有在培养基表面蔓延生长的菌落，从而选择适宜的菌落总数测定方法。培养基的菌落蔓延生长是由于培养基表面游离水而助力细菌游动所形成，各个文献方法均是旨在减少其影响，从而降低菌落蔓延生长情况。本次研究中的覆盖法能大大减少平板菌落蔓延生长的情况出现，但此次研究食品种类较为单一，以后的研究可以扩大食品类别。覆盖法不失为一种简便有效降低菌落蔓延生长的方法，但仍然有个别平板蔓延情况发生，导致菌落计数不准确，实验人员可依据检验产品和目的选择合适抑制菌落蔓延生长的检验方法。