动物疫病监测样品采集操作要点及注意事项

江美莲

（池州市动物疫病预防与控制中心 247100）

随着畜牧业的发展和科技的进步，近年来动物疫病实验室检测能力进一步提升，动物疫病监测工作在高致病性禽流感、非洲猪瘟等重大动物疫病防控工作中所起到的作用愈发明显。基层动物疫病预防控制机构通过疫病监测工作的开展，能及时掌握辖区内畜禽某种病原感染和分布情况，发现疫病传播的风险因素，评估畜禽群体免疫效果，有效控制相应动物疫病的发生与发展。而样品采集工作是动物疫病监测中至关重要的环节,是实验室检测工作的基础，最终影响监测结果的可信度以及能否反映出当地动物疫病的真实情况。因此，采样人员务必要掌握正确的样品采集方法，规范使用采样器具，明确采样注意事项，安全保存和运输，确保待检样品的有效性。

1 样品种类

动物疫病监测常用样品主要可归纳为血液、组织和拭子三大类。其中血液样品又分为全血抗凝血、抗凝血浆和非抗凝血析出的血清；组织样品有实质器官、淋巴结、扁桃体以及皮肤等；拭子样品主要有沾取呼吸道分泌液的口腔/喉气管棉拭子、获取粪便的泄殖腔（肛）棉拭子、病患部水泡液拭子以及环境棉拭子等。不同种类的样品采集时操作技术要点也有所差别。

2 采样原则

采样人员在采集样品时，需要遵循以下原则：一是采集的样品必须具有足够的代表性；二是要根据检测项目和内容来选择相应的采样时间；三是采样过程中要严防造成环境污染和疫病传播扩散。天然孔流血、血凝不良的病死动物，首先应采取耳尖血涂片，排除炭疽，要做好个人防护，做好环境消毒和废弃物处理，严防病原扩散。

2.1 保障样品的代表性

采集样品必须要考虑样品是否具有代表性，充分展示目标群体特性，抽样调查是借助于抽样数据来分析总体情况。在实际采样的过程中，采样人员要充分考虑待监测区的布局、动物种类、数量、迁徙习惯、流通情况等因素，通过建立代表监测点，来了解总体情况，根据疫病流行规律、监测目标、采样方法等进行采集。随着实验室检测检验技术的不断改进和发展，技术创新层出不穷，采样人员在样品采集之前，要充分了解检验相关要求，有针对性地采集相应样品。

2.2 保证样品的时效性

采样前，必须考虑采样的目的，根据需要检测的项目和内容，选择最恰当的时机进行样品采集。例如，目前动物疫病监测实验室主要是抗体检测和病原检测，这两种物质会随时间产生变化。在注射疫苗或感染病原后，机体内不同时期抗体或病原浓度有较大差距，进而导致监测数值出现变化。死亡的动物尸体腐败速度受外界环境如温度等因素影响较大，病料采集时间要求较严。动物机体状况瞬息万变，检测结果仅代表样品采集当时动物的身体情况，因此要注意监测结果的修复和整理，提升疫病监测的准确度。

3 动物疫病监测采样技术要点

3.1 器械工具

包括采样箱、保温箱或者保温瓶、一次性注射器（针头）、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、碘酒棉、棉签、玻片、无菌棉拭子、试管架、冰袋等采样用品；离心管、平皿、塑料瓶、样品自封袋、塑料包装袋等样品容器；记号笔、签字笔、标签、封条、胶布、采样单等采样记录用品；以及根据需要可能用到的阿氏液、PBS 液、30%甘油盐水缓冲液、肉汤和双抗等保存液；此外，还需配备口罩、防护镜、一次性手套、乳胶手套、防护服、胶靴等人员防护用具。

3.2 血液样品采集

3.2.1 采集部位

基层实际工作中常见动物采血部位：禽类进行常规免疫抗体监测时，通常选择翅下静脉；小猪采血一般选择前腔静脉，大猪或成年母猪较难保定，前腔静脉采集对采样人员技术娴熟性要求较高，可使用一次性真空采血管采集耳静脉血；牛、羊通常选择颈静脉。

3.2.2 全血（抗凝血）样品

使用一次性注射器抽取合适位置的静脉血，血液采集完成后及时加入抗凝剂，充分混合，防止血液出现凝固现象；或者使用一次性带管针头插入静脉后，直接连接负压医用抗凝管收集。轻柔缓慢旋转晃动，将收集的抗凝血混合均匀，静置一段时间，可得上清血浆。

3.2.3 血清（非抗凝血）样品

不添加任何抗凝剂，使用一次性注射器直接采集血液样品2～5mL，夏天室温下倾斜静置30～50min，冬天室温下倾斜静置2～4h，也可37℃下静置40～50min，血液凝固后析出上清血清，3000r/min 离心5min 左右，将血清移入塑料离心管中，4℃保存待用。但若需保存较长时间，则要冻结保存于-20℃左右的环境中。

3.3 组织样品采集

3.3.1 皮肤样品

采集皮肤样品一般选择病变最典型处连同周边健康部分一起。例如，进行口蹄疫病毒检测时，可选取新鲜的结痂或水泡皮，使用清水对采集部位进行冲洗，剪取3～5g 的份量采集完整的结痂和完整水泡，或者用无菌注射器吸取不少于1mL 的水泡液，将样品放进事先加入50%甘油或者磷酸盐缓冲液的灭菌瓶中，盖上盖子密封瓶口。同种同群动物一般采集3～5 头病畜，样品采集完成后要及时进行冷冻保存。

3.3.2 实质器官

采样前对解剖刀具等进行彻底消毒，采样过程中如果器械工具被污染，要使用酒精灯进行火焰消毒。按照由上到下、从外到内、胸腔到腹腔的顺序将需要的样品依次采集，样品放置于一次性塑料灭菌袋或自封袋中，密封袋口，用记号笔对动物种类、组织名称、采样日期、编号等内容进行标注，每一个样品单独放置，避免交叉感染。

3.3.3 牛、羊脑

使用消毒后的剪刀从病死牛（羊）枕骨大孔处将脑硬膜剪开，向枕骨大孔中伸入食指，顺时针旋转一圈，将脑髓与腔壁相连的神经、血管等有效切断，进而能顺利地挖出脑髓。然后抽出食指，贴着枕骨大孔腔壁将采样勺插进去，按照大约牛脑5～7cm、羊脑4cm 的标准控制插入深度，抽回采样勺，将脑组织往外挖出，即可完整取出延脑。

3.4 拭子样品采集

3.4.1 禽口腔/泄殖腔拭子

对禽类进行高致病性禽流感等病原检测时一般采集口腔（喉气管）和泄殖腔拭子样品。具体操作是一手固定禽头颈，使其口腔张开，一手持经过消毒灭菌的棉拭子从禽口腔向咽的后部插入，擦拭、旋转后取出，放置于加入缓冲液的离心管中；一手提起尾羽，一手拿着棉拭子插入泄殖腔内，深度约在1～5cm 之间，轻轻旋转后抽出，将沾有泄殖腔黏膜表层的粪便、组织的棉拭子放入含有约2mL PBS 液的离心管中。折断棉棒，盖上离心管盖子，确定密封好无渗漏，做好标记，保存于低温环境中。

3.4.2 牛羊O/P 液

口蹄疫病原检测经常采集此样品。采样前，将探杯浸泡在1%氢氧化钠溶液或0.2%柠檬酸溶液中3～5min，然后用与待采样动物体温接近的清水冲洗探杯。对动物进行保定处理，在动物吞咽时向食道5～10 cm 处插入探杯，来回抽动2～3 次后拉出探杯，即可采集到5～10mL 的O/P 液[1]。将采集到的O/P 液倒入含有磷酸缓冲液或者等量细胞培养液的灭菌瓶中，摇晃均匀后封口保存。每采集完成一头动物，均要彻底消毒、冲洗探杯，避免动物交叉感染以及食道灼伤。

3.4.3 环境拭子

用生理盐水浸湿无菌棉拭子后，在环境（物品）表面按“Z”字形轨迹画线，边画边旋转棉拭子接触面，连续数次，画线区域尽可能覆盖环境（物品）界面，面积越大，采集到病原的机会越大，采集完成后将棉头放入洁净的1.5mL 离心管中，加入保存液，折断棉签杆，盖紧盖子，做好标记。通常一个离心管中放2 个棉拭子。

4 样品采集过程中常见问题

4.1 样品的真实性存疑

由于对动物疫病监测工作的意义和作用认识不够，部分基层畜牧兽医工作者遇到例如养殖场（户）不配合，担心畜禽产生应激反应，不利于生长等困难；或者采样技术不娴熟，难以顺利采集足够的样品等情况时，为了完成采样任务数量，可能会出现将一个样品分成好几份的情况，那么样品的代表性和真实性就出现了偏差。

4.2 血液样品的质量不过关

实际采样工作中，血清样品会因为采血量过少，分离出的血清量达不到检测需求，或者反复冻融等原因造成质量下降。血液样品时常会出现溶血现象，其产生原因可能有以下几种，一是采血技术不熟练，针尖在血管中反复进出造成血肿，在血肿的地方抽取血液；二是排血到容器中速度过快致使红细胞破裂；三是采血的注射器或容器受到了污染；四是采血之后没有对样品进行适当温度保存或者没有及时送到实验室处理；五是血样容器放置不稳倾倒了或者在送样的过程中受到了震荡[2]。

4.3 组织样品采集不规范

对病料组织进行样品采集时，没有选择特定部位，采集的样品没有代表性；动物死亡后间隔了太长时间才进行采样，采集到的组织样品已腐败变质，被其他物质或病原等污染；不按规定量采集病理组织，样品体积太大或过小；采集同一动物体的不同组织样品时，将所有病料混在一起，没有独立封装、存放。

4.4 其他问题

没有进行必要的采样前准备工作，样品采集所需器具、防护用品等有遗漏，或者未携带采样登记表；棉拭子样品采集过程中，没有在塑料离心管中加入保存液；离心管的盖子没有盖（拧）紧，液体渗漏出来，造成交叉污染；样品编号不规范，采样登记表记录不详细，例如畜禽日龄、免疫情况等信息填写不全，后期难以追溯。

5 动物疫病监测采样注意事项

5.1 采样全程需无菌操作

样品采集所用到的器械、工具等均要求无菌，用于储存样品的容器必须保证完好无损，并且密封性好，采集过程满足无菌操作要求。采样人员务必注意做好个人防护，穿防护服，佩戴口罩、手套、鞋套，防止操作过程中接触病原，造成生物学安全事故。需要剖解后采集内脏器官等组织样品时，遵循从胸腔到腹腔的顺序进行，先采用无菌的方式采集动物的实质器官，避免受到外界的污染，后采集胃肠和粪便等可能受到污染的组织[3]。

5.2 样品的数量和质量要符合要求

要结合监测目标、监测方案及实验室的检测能力等多种因素，根据相关标准采集适当的样品数量，提升有效性、满足检测需求的同时，还要留出备用量，防止做必要的重复检测时分量不足。

为保证血液样品质量，采样时需注意：如果使用的是一次性真空管，采血过程中血液应不间断地流入管中，一旦血流间断，则要另换管，否则不易析出血清；使用一次性注射器采血结束后，如果血液暂存注射器内，要将活塞缓慢拉出液面一段距离，中间留有一段空气；如果将血液从注射器移入试管，要沿着试管壁缓慢徐徐注入，不能有气泡，也不能震荡，倾斜静置。

5.3 注意样品种类和时效

要根据检测目标有针对性地选择相应时间段来进行样品采集。①病原监测。要根据不同种类病原特性、发病动物临床症状、是否进行过治疗以及曾经有无发病史等情况综合考虑，选择相应的时间和部位进行样品采集。活体动物一般采集其血液、乳汁、口鼻及生殖道分泌物等；死亡动物，采样需越快越好，特别是气温较高的夏天，其内脏病料不能超过6h，气温较低的冬天也不要超过24h，时间耽搁得越长，越容易产生不合格样品。②抗体监测。根据不同疫苗注射后在机体产生抗体的浓度选择适当的采样时间。例如，禽流感、口蹄疫一般选择在免疫21d后进行；猪蓝耳病则选择在免疫28d 后再进行[4]。需要注意的是采血之前最好让待采动物禁食8h 左右。

5.4 样品的保存和运输

采样完成后，样品要遵循严格的保存和运输规定，否则，很可能造成样品失效。原则上，一种样品只能装置在一个容器里，并且要及时地密封。如果用的是塑料袋，保险起见，最好使用两个，且两个袋子都要封口，防止样品漏出。采样时如果气温较高，须配备冷藏设备；若时间短距离不远的话，可用冰袋降温。按照相应的存放要求及检测目的，及时运送到检测机构。比如，需要进行细菌检测或者寄生虫检测的样品，冷藏后需要在24h 内运送到实验室检测；需要检测病毒的组织或棉拭子样品，需在数个小时内运送到检测室；血液样品如果现场没有条件分离血清，必须在24h 内送达实验室进行处理、保存，若无法及时送检，就要保证一直处于-20℃的冷冻环境中。在保存和运输样品时要避免光照、震动等因素，最大限度地进行平稳运输，确保其完整及稳定性。

6 结语

样品采集是基层动物疫病防控工作者常态化、基础性的工作，如果采集过程不规范，用于实验室检测的样品的代表性和针对性不能保证，动物疫病监测工作的推进将会受到很大影响。动物疫病预防控制等相关部门应该加大经费投入，加强培训，组织相关人员学习并掌握样品采集的操作技术流程和注意事项，保障样品质量，以利于有关工作的进一步开展。