正确认识和应用布鲁氏菌虎红平板凝集试验

邵卫星，盖文燕，左媛媛，孙明军，焉 鑫，孙世雄，刘蒙达，张研博

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

布鲁氏菌病（简称“布病”）是由布鲁氏菌引起的一种严重威胁动物和人类健康的全球性重要人兽共患病。本病主要引起动物流产、不孕和不育，以致降低生产性能。人感染布鲁氏菌后主要表现为波浪热、关节痛、肌肉痛和不育；如果不及时治疗可转为慢性，往往难以治愈。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报的多种动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。近年来，我国畜间和人间布病疫情持续加重，病例数量一直维持高位，每年因患布病导致的流产和产奶量下降给奶牛业带来很大经济损失。在开展布病诊断、监测、阳性动物筛查等工作时，虎红平板凝集试验（rose bengal test，RBT）是一种必不可少的、经典的常规抗体检测方法，尤其在人力、财力和物力有限地区，RBT 以其操作简单、不需特殊仪器设备、获得结果快、结果直观、成本低等优点而被广泛使用[1]；但在实际应用中，由于对其特性缺乏足够了解和认识，常出现检测结果不准确、结果解释不规范等问题而导致被“误用”，从而影响了RBT 在布病防控中所应起到的作用。本文将从动物感染布鲁氏菌后产生抗体的种类及特点，凝集反应中存在的“前带现象”和非特异性反应，以及RBT 的特性，阳性结果需“确证”及不同临床情形下的应用5 个方面进行阐述，使相关职业人员能认识和理解RBT特点，在布病防控中能合理解释和应用其检测结果，避免RBT 被“误用”，以利于发挥其应有的作用。

1 动物感染布鲁氏菌诱导产生的抗体种类及特点

布鲁氏菌是细胞内寄生菌，可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。在血清、乳汁、阴道分泌物、关节水瘤液和精液中都含有布鲁氏菌抗体[2]。光滑型布鲁氏菌（通常为牛种、羊种和猪种布鲁氏菌）感染动物后，细菌脂多糖（S-LPS）能诱导机体产生强烈的、不同抗体类型的体液免疫反应。例如，牛感染牛种布鲁氏菌后产生的抗体类型包括IgM、IgG1、IgG2 和少量的IgA，但以IgG1 为主。感染布鲁氏菌后，不同类型抗体出现的先后顺序不同，一般先产生IgM，然后很快转换为产生IgG。抗体类型转换需要的时间很短，如犊牛和成年牛可分别在感染后4 d 和7 d 内完成抗体类型转换[3-4]。在正常生理条件下，IgM、IgG 和IgA 可分为凝集抗体、非凝集抗体和阻断抗体。一般来讲，凝集抗体包括IgM、IgG 和IgA，非凝集抗体包括大部分IgG1 和血清中部分IgA（不包括奶中的IgA）。一些血清还含有所谓的“阻断抗体”。该抗体是非凝集抗体的一个亚类，与凝集抗体共存，在正常生理条件下可以阻止凝集抗体发生凝集。当血清中的“阻断抗体”效价过高时，就不发生凝集反应和沉淀反应。动物感染布鲁氏菌（包括疫苗接种）后，首先产生凝集抗体，达到峰值后逐渐被非凝集抗体取代[5]。

2 布鲁氏菌抗体凝集反应中存在的“前带现象”和非特异性反应

2.1 “前带现象”

在体外生理（生理pH 和离子浓度）条件下，布鲁氏菌与阳性血清发生的凝集反应会受到阻断抗体影响，出现所谓的“前带现象”，即在抗体浓度高的时候，反而出现非凝集现象。但血清经过稀释，降低了阻断抗体的滴度，可使阻断凝集反应的效应消失[5]。实际上，含有高滴度IgM 或凝集抗体的血清一般不会产生“前带现象”，通常只在加热处理一些血清（为排除IgM 干扰）时才出现。这表明“前带现象”是凝集抗体（IgM、IgG 和IgA）和非凝集抗体（IgG1 和IgA 部分）之间竞争的结果。这两类抗体在血清中的滴度和亲和力，随动物感染布鲁氏菌的时间进程而不同。因此，“前带现象”可降低凝集试验的诊断敏感性（DSe）。

2.2 非特异性凝集反应

在体外生理条件（生理pH 和离子浓度）下，凝集反应还会受到非特异性凝集反应影响。非特异性凝集主要来自两个方面：一方面来自布鲁氏菌抗原与血清中其他抗原的IgM 抗体发生非特异性凝集反应。据估计，约0.6%无布鲁氏菌感染牛的血清（布鲁氏菌抗体阴性）在1:100 及以上稀释时，可对光滑型（S 型）布鲁氏菌产生凝集反应。研究[6]表明，没有感染布鲁氏菌的小母牛血清中含有的IgM，在ELISA 试验中也可以与布鲁氏菌脂多糖（LPS）结合，其中与粗糙型菌（R 型）LPS的结合强度比与S 型菌的高。这一非特异性结合现象在大肠杆菌和假单胞杆菌中也存在。出现非特异性凝集反应的原因是，血清中的非布鲁氏菌抗体IgM 通过其Fc 部分，能够识别布鲁氏菌和其他革兰氏阴性菌的LPS 核心脂质A（lipid A-core）上共有的抗原决定簇[7]。如果抗原悬液中含有裂解的布鲁氏菌，就会加重这种非特异性凝集。另一方面是因为布鲁氏菌胞外多糖（OPS）与一些革兰氏阴性菌的OPS 存在抗原交叉。在这些细菌中，小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型O:9（Y.O:9）可与布鲁氏菌OPS 产生强的交叉反应，是布鲁氏菌抗体检测中出现假阳性反应（FPSR）的最常见因素。Y.O:9可感染牛、猪，也可感染绵羊。在反刍动物中，引起布鲁氏菌抗体FPSR 的细菌可能还有大肠杆菌O:157 和沙门氏菌群N（O:30），但这些细菌表现出的抗原交叉反应性较低[8-10]。尽管霍乱弧菌O:1和一些嗜麦芽窄食单胞菌的OPS 中也携带有N-替代的过氧胺[11]，但从来没有报道过其在反刍动物中可引起FPSR。因而，很难确定引起FPSR 的所有来源[12]。

3 RBT 特性

3.1 酸化处理RBT 抗原

为消除凝集反应中的“前带现象”和非特异性反应，人们采取了多种措施，来降低或排除血清中IgM 对凝集反应的干扰。常用方法包括：向血清中加入EDTA 和利凡诺，优先沉淀IgM；对血清加热，向血清中加入硫醇或酸化血清，使血清中的IgM 变性。在这些措施中，使血清酸化是消除“前带现象”和非特异性凝集反应的最有效方法，但对因存在抗原交叉（如耶尔森菌O:9）细菌感染产生的非特异性凝集反应无效。

为了区分特异性凝集和非特异性凝集，Rose 和Roepke 在1957 年报道了一种经过改进的RBT。他们发现，在检测前将所用的抗原缓冲液处于pH4.0 条件下，可抑制牛种布鲁氏菌抗原与牛血清的非特异性反应，而血清中的布鲁氏菌抗体活性却基本不受影响。向血清中加入弱酸，使血清pH在3.7～4.1 范围内，可最大程度消除非特异性凝集；pH 在3.8～4.2 范围内，牛血清的缓冲能力最强。乳酸和醋酸对酸化牛血清最有效[13]。由于直接酸化血清不方便操作，改为酸化RBT 抗原，当抗原与血清混合时，血清得到酸化，从而达到抑制非特异性凝集反应的目的。RBT 抗原经过酸化处理，可有效消除凝集反应中的“前带现象”，这是由于存在非布鲁氏菌抗体IgM，从而使产生的非特异性反应大大降低。尽管在pH3.8～4.2 范围内，酸化抗原可以极大减少非特异性凝集反应，但该条件下抗原不稳定，为此1965 年美国农业部（USDA）国家动物疫病实验室对酸性平板凝集试验进行修改，采用虎红染料对牛种布鲁氏菌悬液染色，并将缓冲液pH 调整为3.65[14]。该试验方法在美国称为卡片试验（card test），而在其他国家，如法国、英国等，称为虎红平板试验（RBPT），后来简称RBT[15-16]。研究[17]发现，在pH3.65 条件下，IgG1 的非凝集特性转变为能凝集布鲁氏菌。IgG1 凝集能力改变的原理并不清楚，推测可能是在酸性条件下，打开了IgG1 的铰链区，使抗体分子变为二价，使其具有凝集布鲁氏菌的能力；诊断实验室在持续检测中发现，在pH3.65 条件下开展RBT 检测，血清中存在的阻断凝集效应和相关的“前带现象”也消失了。

3.2 RBT 抗原需经标准化

制备RBT 抗原所用的菌株、培养菌的批次，特别是抗原浓度，能对RBT 性能（敏感性和特异性）造成很大影响。为使RBT 性能保持一致，需用参考血清对不同菌株和批次的RBT抗原进行标准化，这是非常重要的。世界动物卫生组织（WOAH）的参考血清被认定为国际标准血清，是所有其他标准血清（如国家标准血清、工作标准血清）进行校准的依据。用国家标准血清对RBT 抗原进行标准化，可使不同厂家制备的RBT 抗原达到统一标准，使检测结果在国内具有一致性。但需要注意的是，抗原标准化并不一定意味着RBT 具有最佳的诊断敏感性（DSe）和诊断特异性（DSp），还需用血清盘进行验证，以获得最佳检测性能。

常用的RBT 抗原标准化方法是，将牛种标准阳性血清用0.5%石碳酸生理盐水或生理盐水进行1/45 和1/55 比例稀释，按RBT 试验程序检测，抗原应与1/45 比例稀释的标准血清发生清晰的凝集反应，但不与1/55 比例稀释的标准血清发生可见的凝集反应[1]。用该方法标化的RBT 抗原在检测小反刍动物（如山羊、绵羊等）血清时，会降低其敏感性，与补体结合试验（CFT）检测结果存在偏差[18]，因此，当RBT 用于检测小反刍动物血清时，为提高敏感性，可将血清和抗原的体积比改为3:1（如分别为 75 μL 和25 μL），而不是标准操作程序中的1:1，但该方法并不适用于检测牛和猪血清。

3.3 RBT 的诊断性能

经过抗原酸化的RBT，其诊断性能得到大大提高，在诊断布鲁氏菌感染方面，比试管凝集试验（SAT）更准确。

具体表现在：一是诊断特异性得到提高，这是因为消除了由非布鲁氏菌抗体IgM 引起的非特异性凝集反应；二是诊断敏感性也大大提高，对于某些血清样品，SAT 检测（生理条件下pH7.2～7.4）结果为阴性，而用RBT 检测，结果可能为阳性（这是因为抗原酸化的RBT 不再受“前带现象”影响，因此比SAT 的敏感性高）；三是能更早地检测出感染布鲁氏菌动物，由于部分布鲁氏菌抗体IgM在酸性条件下仍然具有活性，能与RBT 抗原发生凝集反应，因此比其他试验方法，如补体结合试验（CFT）、间接ELISA，能更早地检测出感染布鲁氏菌动物。

不同厂家生产的RBT 抗原凝集IgG2 和IgM的能力不同，但是都能有效凝集IgG1，这使得RBT 的检测结果与CFT 结果有非常好的一致性（因为CFT 也是检测IgG1）。研究[15]表明：将联合使用CFT 和SAT 获得的试验结果与RBT 结果进行比较，可获得90.8%的一致性，随后又证明一致性可高达97%；以联合使用SAT 和CFT 的检测结果作为“金标准”，RBT 的敏感性和特异性可分别达到96%和97%，从而说明抗原酸化的RBT具有更好的检测性能。RBT 已成功用于美国和欧洲布病根除计划中。但在酸性条件下，抗体与抗原的结合强度降低，与其他方法（如CFT）比较，对于抗体效价低的血清，能降低RBT 的分析灵敏性（最小检出能力），但不会对敏感性造成不良影响[19]。需要注意的是，必须在抗原与血清混合后4 min 内判读结果，如果时间延长，有时就会因为出现纤维蛋白凝块而导致假阳性。

4 RBT 阳性结果“确证”

4.1 RBT 阳性结果需要“确证”的起因

RBT 无法区分S 型布鲁氏菌疫苗免疫产生的抗体和野生布鲁氏菌感染诱导的抗体。在免疫情况下，RBT 的特异性大大降低。在20 世纪60 年代末，人们发现犊牛接种S19 疫苗后12 个月，用RBT 进行检测，还有相当比例的牛能被检测出疫苗抗体，但是用CFT 检测，在免疫后几个月（通常6～8 个月）就检测不出疫苗抗体。在免疫状况下，由于CFT 比RBT 特异性高，在实际检测工作中，开始将CFT 与RBT 联合使用，即用CFT 对RBT 阳性结果进行确证[20]，以增加检测的特异性，减少疫苗抗体阳性动物被“冤杀”。因此，在疫苗接种的情况下，CFT 成为RBT 阳性结果的“确认性”检测方法，并在一些国家被推荐使用[1]。这就是在免疫情形下RBT 阳性结果需进行“确证性”检测的起因。

4.2 对RBT 阳性结果进行“确证性”检测的误用

在实际检测中，对RBT 阳性结果需再次进行“确证性”检测这一做法常存在误用，即无论流行病学背景如何以及是否免疫接种，RBT 阳性结果都必须用CFT 或其他检测方法（如iELISAs、cELISAs、SAT）进行“确证性”检测。根据历史经验和近期研究，在没有接种疫苗的情况下，RBT的敏感性和特异性较高，均超过95%[21-22]。因此，在布病流行地区（或养殖场），对于非免疫动物，特别是为评估群体流行率而开展抗体检测时，RBT阳性结果无需用其他方法进行确证。一些国家实施S19 疫苗接种和联合使用RBT-CFT 进行检测的防控策略，成功根除了牛群中的布病。该策略之所以能成功，是因为这些国家具有良好的基础条件，能对可疑畜群（群中存在RBT 阳性，但CFT 为弱阳性的动物）不断进行重复检测，跟踪这些可疑动物CFT 抗体滴度的变化，从而做出准确诊断。尽管如此，该策略也不可避免地导致相当比例的接种疫苗动物被认为感染了布鲁氏菌而被“冤杀”，增加了额外的资金补偿。

4.3 SAT 不适合用于对RBT 阳性结果进行“确证”

我国现行的《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18648—2018）将SAT 作为RBT 阳性结果的确证方法，但有研究[15]表明，用SAT 检测接种S19 疫苗牛血清，其特异性并不高。一些成功实施牛群布病根除计划国家的经验表明，SAT（或含巯基乙醇的SAT）并不能很好区分野生布鲁氏菌感染抗体和S19 疫苗抗体[15-16]。同时，必须注意到，SAT 只能检测血清中的IgM 和凝集抗体，而这二类抗体通常在动物感染布鲁氏菌的早期产生，因此SAT 更适于早期感染的检测，而不适合感染后期的检测，特别是不适合对慢性感染动物的检测。但RBT 不存在上述问题。在一项研究[23]中，比较了几种检测方法，结论是RBT 和iELISAs 敏感性高，而SAT 是一种较差的检测方法。WOAH 的《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2020 年版）中有关SAT 的描述是，在国际贸易中用SAT 诊断布病，结果通常是不可靠的。在该手册的“牛种、羊种和猪种布鲁氏菌感染的诊断方法”列表中，明确指出SAT 不适用于疑似或临床病例的确证[1]。

5 在实施布病防控计划中正确使用RBT

根据RBT 特性，自1966 年，它作为一种布病筛选试验而被广泛使用。在一个国家、地区或养殖场实施布病预防、控制或净化措施时，RBT 主要用于以下几种情形。

5.1 在采取防控措施前评估动物群体流行率

在实施布病防控措施前，评估当地动物群布病流行率（在个体水平，更重要的是在群体水平上）对于评估布病在当地造成的危害以及决定采取哪种干预策略至关重要[24-26]。在资源有限地区（通常指自由放牧和轮牧饲养模式，但有时也包括中小规模密集饲养模式），RBT 以其操作简单、价格便宜、结果易判定的特点而成为评估流行率最实用的检测方法[27-28]。

5.2 在全面免疫的情形下评估疫苗接种效果

在全面免疫（所有动物都进行免疫接种）情形下，评估疫苗接种的有效性是首要目标，而将检测和扑杀布鲁氏菌感染动物作为次要目标。抗体阳转率是评估疫苗接种有效性的重要指标。接种疫苗2～3 周后，用RBT 检测接种疫苗（S 型）动物，评估抗体阳转率。长期实践经验表明，接种动物的抗体阳转率达70%～90%（如果经眼结膜途径接种，抗体阳性率会低一些，一般在60%以上），证明本次疫苗接种有效；如果接种动物的抗体阳转率低于50%，表明疫苗接种效果不良，不能提供足够的免疫保护[29-30]。

5.3 在采取“免疫+检测+扑杀”防控策略情形下初筛布鲁氏菌感染动物

当采用“免疫+检测+扑杀”防控策略时，一般只对未成年动物进行免疫，在动物性成熟后（牛一般在接种后12 个月，羊一般在接种后6 个月）用RBT 进行检测。检测的目的是初筛布鲁氏菌感染动物。在免疫情形下，RBT 的特异性会下降。为排除疫苗抗体对RBT 结果造成的干扰，需用特异性更高的确证性试验（如CFT 和HN 琼脂扩散试验等）[29]或补充性试验（如iELSA、cELISA、FPA 等）[27]，对RBT 检测为阳性的血清样品进行再次检测，确证动物是否感染野生布鲁氏菌，以减少疫苗抗体阳性动物被“冤杀”。在此情形下，选择合适的检测时机也非常重要。检测时机通常与接种动物的日龄、剂量、途径、频次及疫苗的菌株等因素有关，而且需有经验的流行病学专家根据当地布病流行的具体情况，确定合适的检测时机[31-32]。

5.4 在无疫状态下证明动物群无布病

对于无布鲁氏菌感染的动物群，可将RBT 作为一种群体水平的筛查方法，在适当时机（一般1年2 次）对全群动物进行检测，证明无布病，即可确定动物群无布鲁氏菌感染[1]，以维持动物群的无疫状态。在这种情形下，对于RBT 检测出的阳性动物，一般需用病原学方法（如细菌分离鉴定、荧光PCR 等）在合适的时机（如产后1 个月内）重新采集样品，进行确证检测（因为此时血清学检测方法的阳性预测值非常低，即阳性结果的可靠性低），以提高检测的特异性。

6 总结及展望

作为一种经典的常规方法，RBT 是常用的布鲁氏菌抗体检测方法之一。RBT 经过抗原酸化处理后，其敏感性和特异性大大提高。在免疫或布病流行率很低的情况下（流行率几乎接近于0），RBT 检测出的阳性动物需用特异性更好的“确证性”或“补充性”试验进行再次检测，以尽可能减少疫苗抗体对布病检测结果的干扰，或FPSR 对可疑病例确诊造成的影响。但在布病流行地区，对于非免疫动物，无需对RBT 检测出的阳性样品进行再次确证。应根据不同的临床情形正确选择使用RBT，避免被“误用”。应选用经过标准化的RBT 抗原试剂，否则会影响RBT 性能（敏感性和特异性）和检测结果的正确性。认识和了解RBT的特性，根据不同临床情形正确解释和应用检测结果，不但可以降低布病检测成本，而且可极大发挥RBT 在布病防控中的作用。