人源化实验动物模型在生物医药领域的应用及质量控制

张妙红，曾贵荣，姜德建，3*（1.湖南省实验动物中心，长沙 410331；2.新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，长沙 410331；3.肿瘤模型与个体化诊治湖南省重点实验室，长沙 410011）

人源化实验动物模型是将来自于人的基因、细胞或组织针对性导入到实验动物体内，使其获得与人类更为接近的生理病理特征[1]。人源化实验动物模型可用于人感染性疾病的发病机制、病理过程的研究等，可作为非人灵长类动物的替代动物模型，在肿瘤精准治疗、药物研发、抗体开发等生物医药领域有广泛的应用价值。但目前人源化实验动物模型缺乏规范的制备程序和质量控制标准，导致其临床表型和对药物反应不尽相同，极大地限制了其在生物医药工业领域的应用。因此，对人源化实验动物模型质量进行系统研究，加强其标准化和一致性，将有助于推动其在生物医药领域的应用。

1 人源化实验动物模型的分类

人源化实验动物模型根据构建方式不同可分为两大类：基因型动物模型和移植型动物模型。

1.1 基因型人源化实验动物模型

基因人源化实验动物模型是将人基因插入或替代至模型动物基因中，进而产生人基因嵌合动物模型。基因人源化动物模型体内表达部分人类蛋白，能模拟体内蛋白反应或者细胞信号传导[2]。

1.2 移植型人源化实验动物模型

移植型人源化实验动物模型是将人（肿瘤）细胞或人（肿瘤）组织异种移植至实验动物体内，继而在动物体内生长。与传统的人恶性肿瘤细胞系来源的异种移植（cell line-derived xenograft，CDX）比较，患者肿瘤组织来源的异种移植（patient-derived xenograft，PDX）能较好地保留患者肿瘤的基因和表型特性，克服了肿瘤细胞系因长期体外培养缺乏正常的细胞基质和肿瘤微环境进而导致同质化改变的缺点，具有更广泛的应用价值[3-5]。

由于异种移植免疫排斥反应难以避免，移植型人源化实验动物模型须提前进行免疫抑制或者采用免疫缺陷动物。将人造血干细胞（hematopoieticstem cells，HSCs）移植至采用低剂量X线全身照射等方法清理骨髓的重度免疫缺陷小鼠，然后再将患者的肿瘤组织移植于该动物建立人源化肿瘤模型（humanized patient-derived xenograft，Hu-PDX）[6]。因人HSCs在小鼠体内可以产生各种免疫细胞，使肿瘤生长微环境与人体更相似，可更好地保留原发肿瘤的异质性。

2 人源化实验动物模型在生物医药领域的应用

2.1 基因修饰型人源化动物模型的应用

2.1.1 在人源化抗体制备中的应用 利用转基因小鼠可实现在小鼠体内制备人源化抗体，达到生产治疗性抗体。与体外生产人源化抗体技术比较，通过小鼠体内直接生产的人源化抗体因经过体内自然筛选过程，无论在亲和力、抗体形成的后加工修饰等方面都具有明显的应用优势[7]。如美国Regeneron制药公司研发获得的Veloclmmune小鼠，基于该技术平台已获得包括抗IL-4受体抗体、抑制IL-4和IL-13信号通路以及抗IL-6受体抗体4个人源抗体药物。2017年获批的抗IL-6受体抗体，通过抑制IL-6信号通路，降低肝细胞释放炎症相关因子，实现治疗风湿性关节炎等自身免疫性疾病作用。

2.1.2 在抗体药物评价中的应用 对于肿瘤免疫（CAR-T/Checkpoint），其作用方式是调动自体免疫进行杀伤，故需要有一种模型在临床前阶段模拟人体内的免疫环境。通过基因修饰将小鼠细胞跨膜蛋白膜外部分进行人源化改造，从而结合基于人蛋白结构开发的抗体药物，可以保留细胞内鼠源的信号通路，激活相关的免疫反应。在抗体药物的体内药效学研究与非临床安全性评价具有广泛的应用价值[8-9]。如采用小鼠T细胞淋巴瘤肿瘤细胞系EL4，在转基因的PD-1人源化小鼠中建立肿瘤细胞系移植模型，用于人源化PD-1单抗联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂罗米地辛治疗T细胞淋巴瘤的临床前研究[10]。通过对免疫检查点相关的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）进行人源化修饰，构建能与抗CTLA4和PD1人源化抗体相互作用的人源化小鼠，可为这类抗体药物的临床前筛选与评估提供有效的工具。

2.1.3 在人感染性疾病模型建立中的应用 乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒等在宿主选择上具有严苛的人细胞嗜性，因缺乏合适的感染动物模型，严重限制了对其致病机制的研究和抗病毒药物及疫苗的筛选进展。人肝嵌合小鼠和重建人免疫系统小鼠则分别突破了这两种病毒的感染限制[9]，为模拟这些病原体自然感染人的过程和产生的病理生理改变、新型疫苗的开发和治疗方法的发展提供了重要研究手段。

2.1.4 在Hu-PDX模型中的应用 在NOG/NSG等免疫缺陷小鼠的基础上，导入与髓系类细胞发育成熟相关的人细胞因子，如IL-3、GM-CSF，具有明显增加移植HSCs在小鼠体内的成熟，提高Hu-PDX模型的成瘤效率[11]。

2.1.5 在药物代谢特征研究中的应用 在基因修饰型人源化模型的研制领域中，已经成功建立了包括针对外源生物质受体[如芳香烃受体（AHR）、组成雄烷受体（CAR）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARa）和孕烷X受体（PXR）等]，针对细胞色素P450（CYP）家族成员的[如CYP2A6、CYP2C9、CYP2C18/2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7]以及针对UDP 葡糖醛酸基转运酶（UGT）、2B7和NAT转运酶2等。与野生型小鼠相比，CYP450基因修饰型人源化模型在药物体内代谢与安全评价方面，更能准确反映人代谢产物的实际状况[12]。

2.2 PDX模型在肿瘤研究中的应用

2.2.1 肿瘤精准医学研究 PDX模型经验证能够保留原发肿瘤的特性，精准模拟肿瘤生长、肿瘤多样性、肿瘤进展及转移潜能等特性[13]。有研究显示，具有不同预后和亚型的肿瘤建立PDX模型仍然会保持原有分型，利用PDX模型进行敏感型和抗药型模型之间的蛋白组学或遗传学比较，可以识别出预后生物标志物，从而进一步进行临床精准治疗[14]。此外，PDX模型还可用于解决许多临床相关问题，包括预测临床预后、临床前药物评估、生物学研究、肿瘤异质性对治疗反应的影响、肿瘤进展过程中和在治疗压力下肿瘤动态进化模式以及对治疗耐受的机制研究。

2.2.2 抗肿瘤药物研发 通过建立特定基因型或蛋白表型的PDX小鼠模型，可针对性地筛选和开发相应靶点的先导化合物，大大促进新型抗肿瘤药物的研发。有研究者在使用重建人免疫系统（HIS）动物建立PDX，构建了重建 HIS＋PDX动物模型，是目前最接近临床肿瘤患者情况的模型，可用于抗肿瘤药物临床前的药效和毒理实验，为免疫毒性的评价提供更多信息，推动抗肿瘤药物的研发。

3 人源化实验动物模型的质量控制

3.1 影响动物模型质量的因素

3.1.1 缺乏统一的技术标准和规范 人源化实验动物的使用目前大多仍停留在基础研究领域，尚未在临床个体化诊疗与新药临床前研究等生物医药工业领域广泛使用，主要原因与其质量保障体系缺乏系统研究，供应链上生产、饲养和应用等多环节相关的技术标准与规范不完善有关。因此，建立人源化动物关键共性技术规范，动物质量评价标准以及在药物研究中如何选择合适动物的技术标准，将有助于推动人源化动物在生物药非临床药效与安全性评价中的广泛应用。

3.1.2 模型制备问题 人源化实验动物模型在肿瘤研究领域取得了重要进展，但仍存在一定局限性，主要表现在：

① 制备周期长，植入率低，成本高；

② 移植到免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤基质细胞和细胞外基质有可能被小鼠组织所替代；

③ 潜在的淋巴瘤转移：如果供体患者有EB病毒感染史，PDX的植入可在宿主小鼠中引起淋巴瘤，但不会引起预期的肿瘤；

④ 肿瘤组织异质性问题：一开始有效的药物，易产生耐药性。

3.1.3 饲养环境问题 人源化动物是免疫缺陷动物基础上再复合了疾病，对饲养环境要求高。国内外尚无对饲养环境参数以及对人源化动物质量影响的研究。

3.2 亟待解决的质量控制问题

3.2.1 基因修饰型人源化实验动物模型 基因修饰型人源化小鼠模型在生物学特性上的差异导致其在药物开发中的应用受到限制，需要从以下几个方面解决一致性和稳定性问题：

① 导入人源基因的技术方法：目前导入人源基因的主要方法有原核注射、利用小鼠ES细胞系进行传统基因打靶、采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，以及在此基础上的技术改进。通过不同技术制备的相同基因型人源化小鼠模型可能存在表型和生物学特性以及对药物的反应不尽相同。

② 小鼠免疫缺陷程度：目前常用的人源化免疫缺陷小鼠有SCID、NOD/SCID以及在此基础上敲除IL2rg基因开发的极重度免疫小鼠（NOD/SCID IL2Rg－/－），这些小鼠在T和B细胞功能恢复、NK细胞活性上均不一致。

③ 基因敲除策略：IL-2Rγ链的缺失会导致T细胞、B细胞发育和功能严重受损，并完全阻止了NK细胞的发育。因此，在NOD/scid背景下通过引入IL2rg突变后就可以形成T细胞、B细胞和NK细胞三种细胞同时功能缺失的小鼠。日本东京大学和美国Jackson实验室先后培育了NOG、NSG和NRG等极重度免疫缺陷小鼠[15]。NOG是在NOD/Shi-scid小鼠导入了一个截短的IL2rg基因（缺乏胞内段，可以结合细胞因子，但不能传递信号），NSG是在NOD/Lt-scid小鼠导入一个完全删除的IL2rg基因。国内李鹏教授研究团队也成功构建了基于IL2rg不同突变体敲除的NSI品系[16]。这些极重度免疫缺陷小鼠尽管在免疫学状态上高度相近，但是在体质量、脐带血移植能力等生物学特性上有差异。此外，人源化动物自身的残余肝细胞对药物代谢的背景影响，易引起肿瘤的发生，稳定性差，从而导致其在新药筛选和安全性评价中的应用受到限制。

3.2.2 移植型人源化实验动物模型 目前PDX在临床肿瘤个体化诊疗中尚未广泛使用，除了模型制备周期长、植入率低、成本高等因素以外，由于肿瘤组织存在异质性和模型制备尚无统一的技术规范密切相关。PDX模型需要在以下几个方面考虑一致性和稳定性问题：

① 人源一致性：临床患者肿瘤组织与人源化动物模型之间病理学、分子生物学、基因特征的一致性；② 同批次一致性：同一批次人源化动物个体之间病理学、分子生物学、基因特征的一致性；③ 传代一致性：不同传代数模型之间及不同代数模型之间病理学、分子生物学、基因特征的一致性；④ 多重稳定性：临床患者肿瘤组织不同传代数模型之间及不同代数模型之间病理学、分子生物学、基因特征的一致性。

因此，完善PDX实验动物模型构建的技术规范和质量标准，是促进PDX模型在临床前研究中广泛应用的关键手段。

4 结语

人源化实验动物模型具有与人更为接近的生理病理特征，在肿瘤精准治疗、药物研发、抗体开发等生物医药领域应用具有一定的优势。进一步加强对人源化实验动物模型质量的研究将有助于推动其在生物医药领域的广泛应用。