鱼类干细胞育种技术回顾与展望

张弯弯，易梅生

（中山大学海洋科学学院，广东 珠海 519082）

鱼类作为人类优质动物蛋白的重要来源，在满足不断增长的食物和营养需求方面占重要地位，其中海水鱼类因富含长链多不饱和脂肪酸、维生素和微量元素，对人类健康尤为重要［1］。然而，目前能进行规模化养殖的鱼类品种非常有限，并且在长期的养殖中面临着种质退化等问题。因此，运用现代生物技术创制新种质、培育优质品种是鱼类养殖业的迫切需求。

品种改良是促进水产养殖业发展的主要手段之一。传统鱼类品种改良的方法主要为选择育种、杂交育种、染色体组操作及性控育种等。近年来，分子标记、全基因组选择、转基因及基因编辑和细胞工程等现代生物育种技术发展迅速［2］。选择育种是指对具有优良性状的个体进行选择和培育，并辅以功能基因相关的分子标记进行选择［3］，但经多代选择后近交衰退现象明显，严重影响育种效率。杂交育种是育种的另一重要方法，20世纪50年代开始在鱼类中广泛应用，通过种间杂交培育了众多养殖新品系［4-5］，但鱼类杂交育种仍存在工作量大、周期长等局限［6］。基因编辑技术为鱼类育种提供了新的技术手段，已应用于多种鱼类品系的培育，包括虹鳟、草鱼、鲤鱼、尼罗罗非鱼和金头鲷等［7］，具有广阔的发展前景。

细胞工程育种是在细胞或染色体组水平上进行遗传改良的育种技术［8］，主要包括多倍体育种、细胞核移植、干细胞和单性生殖等。其中，多倍体育种和单性生殖在鱼类育种中取得了令人瞩目的成就［3-4，9］。近年来，干细胞技术快速发展，本文主要对鱼类干细胞诱导和移植技术的研究进展及其在育种中的应用进行综述，总结鱼类干细胞育种技术面临的问题，并对其发展前景进行展望，旨在为鱼类育种技术研究提供参考。

1 鱼类干细胞

干细胞是在一定条件下具有无限自我更新和发育潜能的一类细胞，根据其来源可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）。自小鼠ESC培养成功以来［10-11］，哺乳动物干细胞在基础和应用研究方面都取得了一系列重大成就。比较而言，低等脊椎动物干细胞研究起步较晚，始于模式动物斑马鱼和日本青鳉 ESC 的培养［12-13］。自 Hong等［14］在青鳉中建立无滋养干细胞培养体系后，干细胞培养技术在多种鱼类中获得成功［15-16］，这些工作为鱼类干细胞的深入研究奠定了基础。先后建立的半克隆（semi-cloning）、移植及诱导等干细胞操作技术［16-17］显示出干细胞在鱼类克隆和良种培育等方面具有重要的应用价值。

2 鱼类干细胞移植及应用

2.1 胚胎干细胞移植

胚胎干细胞具有发育多能性，一定条件下，在体内、体外均可分化为包括生殖细胞在内的多种细胞类型。细胞移植是诱导干细胞体内分化研究的常用方法。在鱼类中，Wakamatsu等［18］使用青鳉囊胚细胞建立了鱼类细胞移植形成嵌合体的方法。随后Hong等［19］将长期培养的青鳉ESC移植到囊胚，发现供体细胞能参与受体胚胎多种组织器官的分化，但未能像小鼠ESC那样实现供体细胞的生殖系传递。尽管Ma等［20］使用短期培养的斑马鱼胚胎细胞成功获得生殖系嵌合体，但鱼类长期培养ESC的有效生殖系传递仍然存在技术瓶颈。

细胞核移植是获得供体细胞来源后代个体的另一方法，即将供体细胞核通过显微操作方法移植到同种或异种动物的成熟卵子中以获得后代个体。早在20世纪60年代，童第周等［21］开创了鱼类核移植研究先河，在金鱼和鳑鱼中证明了鱼类细胞核移植的可行性。1980年，中国科学家以鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合培育出核质杂种鱼，成为世界上第1条克隆鱼，也是第1例可发育成熟的异种间胚胎细胞克隆动物［22］。1986年，我国首次报道体细胞克隆动物的形成，证实成年鲫鱼的体细胞可以去分化和再程序化，具有发育成个体的全能性［23］。此后，核移植技术广泛应用于核质杂种克隆鱼研究，为鱼类核质关系研究和鱼类品种改良的发展作出了重要贡献［24］。鱼类细胞核移植技术多用于未培养细胞或短期培养细胞。对于长期培养细胞的核移植尚有局限性，特别是随着鱼类基因组编辑技术的发展，长期培养细胞的核移植研究更有意义。Lee等［25］将培养12～26周的斑马鱼细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，得到可成活的二倍体后代。Yi等［17］在青鳉中成功培养了单倍体ESC，并将稳定表达荧光标记的细胞核植入成熟卵母细胞中，获得首例可育半克隆（semicloned）鱼Holly，其二倍基因组来源于2个不同个体，类似于有性生殖产生的后代。因此，ESC培养，特别是单倍体ESC培养，结合核移植及基因组编辑等技术是鱼类优良种质创制的重要途径。

2.2 原始生殖细胞移植

鱼类原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）是雌雄配子的前体细胞。脊椎动物PGC移植产生供体细胞来源后代的实验最初在鸡中获得成功［26］。在鱼类中，Lin等［27］将斑马鱼中囊胚卵裂球植入同一发育阶段的受体胚胎中，获得供体细胞来源的后代，表明供体细胞（含PGC和体细胞）成功嵌入受体生殖系并分化为功能配子。Takeuchi等［28］用从养殖鱼类虹鳟早期性腺中分离的PGC进行移植得到了类似结果。种内PGC移植在泥鳅中也有尝试，其PGC移植后产生生殖系嵌合体，嵌合率达25%，且能够产生移植后代个体［29］。在种间移植中，Yamaha等［30］将二倍体金鱼PGC和体细胞的混合细胞移植到三倍体鲫鱼中，成功从嵌合体中获得了金鱼配子。在种间单个PGC移植中，不同属（金鱼移植到斑马鱼）和不同科（泥鳅移植到斑马鱼）间形成的嵌合体也可以产生供体细胞来源的配子［31］。但在不同目或亲缘关系更远的物种间，如日本鳗（Anguillajaponica）到斑马鱼［32］、鲟（genusAcipenser）到金鱼［33］之间，虽能以较低成功率形成生殖嵌合体，却不能产生供体细胞配子。因此，在鱼类中，无论是种内还是种间，通过PGC移植获得供体细胞物种来源的配子切实可行，但由于鱼类胚胎中PGC数量有限，该方法的广泛使用，特别是在养殖鱼类中的使用存在一定局限。

2.3 生殖干细胞移植

原始生殖细胞经过有丝分裂形成精原细胞（spermatogonia）或卵原细胞（oogonia）。作为生殖干细胞，精原细胞也可以作为细胞移植技术的供体细胞。将小鼠供体精原细胞移植到不育小鼠的性腺中，可产生具有供体遗传特征的可育精子［34］。精原细胞由于数量多，且易于分离和纯化，已成为生殖干细胞移植的主要细胞类型。在鱼类中，将包含精原干细胞（spermatogonial stem cell，SSC）的虹鳟精巢细胞分别移植到刚孵化的雌性和雄性胚胎中，雌雄嵌合体可分别形成源于供体细胞的成熟精子和卵细胞，表明SSC在受体胚胎中具有类似PGC的分化能力，并且其分化的配子类型取决于受体胚胎的性别表型［35］。在种间移植中，Okutsu等［36］将虹鳟的精巢细胞移植入马苏鲑鱼（Oncorhynchusmasou）中，性成熟嵌合体成功产生虹鳟功能配子。这些研究表明，无论种间还是种内，移植的精原细胞均可产生可育配子。随后，精原细胞移植研究在多种淡水和海水鱼类中展开，在种内和种间移植的嵌合体中均得到成熟精子或卵子，包括鲤［37］、青鳉［38］和红鳍东方鲀（Takifugurubripes）［39］等模式和经济鱼类。在种间移植中，随着供体与受体种类间的系统发育距离增大，特别是不同科或目间，生殖细胞的移植成功率大大降低。但在淡水鱼中，精原细胞移植技术仍然可以在不同种和不同目间移植，例如泥鳅和斑马鱼（科间）［37］、克林雷氏鲶（Rhamdiaquelen）和尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）（目间）［40］等。海水鱼类由于繁殖周期长、生长环境复杂，精原细胞的移植仅局限于科间，且移植的生殖细胞往往在受体内难以分化为成熟的功能性配子［41］。最近，鲆类科间的精原细胞移植取得重要进展，中国科学院海洋研究所刘清华等将牙鲆、夏牙鲆和大菱鲆的冷冻精原细胞移植到三倍体牙鲆幼鱼体内，分别获得了100%、75%～95%和33%～50%的供体细胞嵌合率，并能够产生源于供体细胞的精子，成功繁育后代（未发表资料）。除精原细胞外，鱼类卵原细胞也可用于移植，Yoshizaki等［42］报道，分离自6～9月龄虹鳟幼鱼的卵原细胞在2种性别的受体中都表现出良好的分化可塑性，在雌雄受体中分别分化为成熟卵子和精子，产生正常后代个体。

综上，生殖干细胞移植在鱼类育种中表现出育种时间短、效率高的显著优势，但该技术操作难度大、技术体系尚未完全成熟以及在不同鱼类中应用的共性问题等需要进一步完善。

2.4 生殖干细胞移植操作过程及影响因素

生殖干细胞移植是近年发展起来并逐步完善的一项鱼类生殖操作新技术，其过程大致可归纳为3个主要步骤：①供体细胞分离、纯化和鉴定；②受体准备；③细胞移植。提高细胞移植成功率的关键在于供体细胞时期的选择和移植受体的制备。

生殖干细胞可从幼鱼或成鱼性腺中通过机械和酶解等方法分离。常用的细胞纯化方法包括密度梯度离心和流式分选等，密度梯度离心的介质包括Percoll、Ficoll和BSA等［43］；流式分选法多用于模式鱼类，通过表达荧光标记的生殖细胞标记基因（如vasa）启动子，借助流式细胞技术可有效分选荧光蛋白阳性细胞，从而达到纯化精原细胞的目的［44］。在经济鱼类中，可用生殖细胞表面蛋白，如虹鳟Ly75蛋白［45］和罗非鱼Gfra1受体［46］等作为精原细胞的细胞表面标记。

生殖干细胞移植受体可以是胚胎、幼鱼或成鱼。除受体与供体亲缘关系和繁殖周期等对生殖干细胞移植的成功率有显著影响外，受体育性也是影响生殖系嵌合体形成的重要因素。移植操作中，合适发育时期的胚胎受体可以直接用于移植，若在移植前去除或减少受体胚胎生殖细胞，则可显著提高移植成功率。目前，生殖细胞去除方法有化学处理、物理处理、遗传操作或组合处理。白消安（busulfan）可通过影响旺盛分裂的细胞去除性腺中的生殖细胞。Lacerda等［47］使用白消安结合热处理罗非鱼成鱼约12周，成功去除精巢中的生殖细胞。染色体组操作是另一种产生不育移植受体的方法，通过二倍体和四倍体个体杂交，或者在受精后对卵子用静水压和热休克等方法处理可产生三倍体不育个体［2］。使用三倍体作为生殖干细胞移植受体在种内和种间移植都有成功的报道［39］。另外，通过基因编辑技术敲除或敲降生殖细胞发育关键基因（如deadend）抑制生殖细胞形成也是消除移植受体生殖细胞的有效方法［48］。

3 鱼类干细胞体外诱导和分化

3.1 胚胎干细胞诱导

ESC具有分化多能性，在体内和体外可分化为各种细胞类型。小鼠ESC可在体外诱导成PGC，并分化为具有功能的精子和卵子［49］。在鱼类中尽管也建立了多种海、淡水鱼的ESC细胞系，但尚没有ESC体外分化成生殖细胞的报道，因此，这是鱼类ESC研究中亟需突破的技术瓶颈。

3.2 生殖干细胞培养和诱导分化

存在于性腺中的生殖干细胞维持着生物体生命周期中配子的发生和世代间遗传信息的传递。同ESC一样，生殖干细胞在合适的条件下可以进行增殖和分化。但相较于ESC，SSC培养技术发展较慢，主要由于SSC在体外培养中难以成为长期稳定生长的细胞系。Hong等［16］首次使用青鳉成鱼精巢建立精原干细胞系SG3，SG3细胞能够在体外培养中长期稳定生长，在适当诱导条件下可进入减数分裂并产生活动精子。

虽然鱼类长期稳定生长的SSC细胞系数量有限，且缺乏分化为功能配子的能力，但通过诱导短期培养SSC体外分化是配子形成的另一可行途径。Miura等［50］将日本鳗的精原细胞进行诱导，在精巢培养体系中用11-酮基睾酮诱导成熟精巢中的A型和早期B型精原细胞进入减数分裂，形成精子。采用类似的诱导策略，精子体外诱导在罗非鱼［51］和青鳉［52］中也得以成功实现。这些体外诱导的精子不论是否具有受精能力都表明诱导鱼类SSC分化为精子是可行的。2002年，Sakai等［53］在以Sertoli细胞作为饲养层的培养体系中，将从斑马鱼精巢中分离的精原细胞诱导分化为功能精子，并通过人工受精获得正常胚胎。随着近年来体外诱导系统的优化，目前已在多种经济鱼类中实现了可育精子的诱导，如胡子鲶［54］、南亚野鲮［55］和虹鳟［56］等。鱼类体外精子诱导体系的建立和优化，为缩短鱼类育种周期提供了技术支撑。

3.3 影响生殖干细胞诱导效率的因素

鱼类生殖干细胞体外成功诱导主要取决于2个关键因素：细胞因子和培养微环境。细胞因子可以显著促进和提高精原细胞的诱导效率。在鳗鱼精原细胞体外分化中，11-酮基睾酮的诱导作用至关重要［50］。内皮细胞生长因子是另一类SSC分化促进因子，Lif、Fgf2和Gdnf等能够显著提高斑马鱼生殖细胞存活率和维持生殖细胞特性［57］。研究表明，胰岛素样生长因子和人绒毛膜促性腺激素也有促进精原细胞增殖的作用［51］。随着研究的不断开展，将有更多更有效的细胞因子被发现。

生殖干细胞的体外分化依赖于特定的微环境。在斑马鱼精原细胞分化中，源于精巢的饲养细胞肿瘤样细胞ZtA6或Sertoli细胞通过表达sox9a等因子来维持细胞分化的微环境［53］。此外，培养诱导体系的空间结构也影响细胞分化效率，在培养系统中模拟体内精巢的囊性结构可显著提高精子的形成效率。Higaki等［58］研究了濒危鱼类暗斑颌须（Gnathopogoncaerulescens）精原细胞的体外分化，发现3D培养体系的诱导效率显著高于2D体系。目前，有各种商业化3D培养系统可用于细胞培养。近期，本课题组以3D trans-well（BD）为基础支架建立3D细胞培养体系，诱导海水鱼中华乌塘鳢生殖干细胞分化，取得了良好效果，诱导30 d后可产生大量可育精子，并能以较高效率授精卵母细胞。将该诱导系统用于淡水鱼斑鳢和草鱼，同样成功诱导出有运动能力的精子（未发表资料）。

4 展望

鱼类主要通过有性生殖繁衍后代。受精卵经胚胎发育形成个体，个体生长到一定阶段达到性成熟，产生生殖细胞，繁育后代。不同种类的鱼繁殖周期存在较大差异，通常从一年到几年甚至十几年。经济鱼类的繁殖周期一般较长，无论是通过选育法还是杂交法，新品种的培育往往需要花费很长时间。生殖干细胞移植和诱导等生殖细胞操作技术能大大缩短配子形成时间，加快育种进程，同时也便于基因操作，因此在经济鱼类育种中具有较高的应用价值。然而，生殖细胞操作技术研究虽然在近年来取得了较大进展，但有一些关键问题亟待解决。①无论是生殖干细胞体外诱导还是移植嵌合体体内分化，其效率均偏低。如何针对特定种类，提高功能配子的产生效率，仍然存在技术挑战。②鱼类种类繁多，其生殖和生理特性多种多样。在生殖细胞移植中，不同目、科、属和种的鱼类间存在细胞排异现象，使供体细胞和受体鱼种类的选择受到限制。如能突破亲缘关系的局限，即可扩大受体选择范围，特别是选择繁育周期短的鱼类作为受体则可显著提高移植成功率。③生殖细胞诱导和移植技术目前只在为数不多的鱼类中取得成功，尤其是在大宗养殖鱼类中的研究较少；同时，用于每种鱼类的移植和诱导体系各有差异，而同一体系用于不同鱼类所产生的效果也差别较大。如用于中华乌塘鳢的3D诱导体系，应用于斑鳢时可较高效率地产生精子，但用于草鱼时则产生较多形态不正常的精子。因此生殖细胞操作应用于各种鱼类的技术共性还有待突破。这需要在更多更有代表性的鱼类中广泛开展研究，积累总结共性技术的基础资料和经验。④生殖细胞操作与其他现代育种技术结合不够紧密。基因编辑技术育种和分子标记辅助育种等是现代鱼类育种的发展趋势［2］，生殖细胞操作技术研究应加强与这些育种方法的结合。同时，干细胞培养和体外诱导技术的发展也为基因编辑技术用于鱼类新种质的快速创制创造了条件。总之，在鱼类干细胞育种技术研究中，应着重解决这些问题。随着鱼类干细胞操作技术的发展，将其与基因和基因组操作技术相结合，通过创制优质“试管配子”以培养鱼类新品种将成为重要育种方法，极大地促进养殖鱼类种业的发展。