基于铂氧化铜负载多壁碳纳米管标记夹心型电化学免疫传感器

孙静波，栾业波，马世花，郑 钊，邢仪雯，张洪静

（1．烟台南山学院 工学院，山东 烟台 265713；2．烟台南山学院 化工学院，山东 烟台 265713；3．航鑫材料科技有限公司，山东 烟台 264006）

乙型肝炎病毒是常见病毒之一，具有广泛的传播性［1］。人血清中乙肝表面抗原（HBs）是一种高特异性、敏感性的（肝）癌标志物，健康人血清中HBs的质量浓度约为25 ng/mL，而肝癌患者血清中HBs的质量浓度明显升高［2］。因此，HBs的灵敏检测对乙肝的早期诊断起着重要作用［3］。目前，已有许多检测HBs的方法，包括时间分辨荧光法［4］、化学发光酶免疫分析［5］、酶联免疫吸附试验［1］和无酶电化学免疫传感器［6］。与这些方法相比，电化学免疫传感器具有检出限低、灵敏度高、操作简便、成本低的优点［7］。因此，制备一种高灵敏电化学免疫传感器用于HBs的检测非常重要。

石墨烯（GS）具有大比表面积、优良机械性能和高电导率，在纳米材料制备中已被广泛应用［8-10］。然而，其在水溶液中的分散性较差，易堆叠。为了提高石墨烯分散性，在完全还原之前将SnO2分子引入到石墨烯中，得到SnO2负载石墨烯（GS-SnO2），SnO2的存在阻断了石墨烯层间的堆叠，同时提高了分散性，增加了石墨烯的结合位点，易于负载大量金纳米颗粒［11］。金纳米颗粒能提高导电性，并具有良好电催化活性［12］。因此，金负载二氧化锡石墨烯（GS-SnO2-Au）是理想的基底材料，可通过金纳米颗粒与—NH2紧密结合固定捕获抗体（Ab1）。

多壁碳纳米管（MWCNTs）作为性能优异的载体材料，因具有较高电导率、良好化学稳定性、大比表面积、高表面/体积比、高机械强度和易于功能化的表面，在电化学分析领域中引起了广泛关注［13］。根据Pietrzak等［14］研究，利用多壁碳纳米管（MWCNTs）和离子液体构建离子选择电极用于硝酸盐的检测［15］。MWCNTs本身对H2O2具有较高催化活性。氧化铜（CuO）作为一种催化剂具有较高的活性和选择性，是目前应用最为广泛的催化剂［16］。而铂电极因具有较高催化活性，被用于过氧化氢的直接检测［17］。

本文以3种材料复合的铂氧化铜负载多壁碳纳米管（Pt@CuO-MWCNTs）作为标记物，GS-SnO2-Au为检测平台，构建了一种夹心型电化学免疫传感器，用于人血清中HBs的定量检测。设计的免疫传感器为检测HBs提供了一个可靠的检测平台，该方法具有较高的电流响应、较宽的线性范围和较低的检出限，可实现对HBs的高灵敏检测，在临床肿瘤标志物筛查、癌症诊断和愈后复发监测方面具有潜在的应用价值。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

HBs抗体、HBs抗原（上海领潮生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，96%~99%）、聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）购自Sigma公司；GS-SnO2（SnO2含量：50%，石墨烯：500 nm~5 μm）购自先丰纳米科技有限公司；多壁碳纳米管（直径10~20 nm，长度30 μm，纯度＞95%）、四氯铂酸钾（K2PtCl4）、乙酸铜（Cu（CH3COO）2·H2O）购自阿拉丁公司。采用1/15 mol/L KH2PO4和1/15 mol/L Na2HPO4制备磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7．4）。其他化学品均为分析纯，实验用水为超纯水。

CHI760D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；H-600透射电子显微镜（TEM，日本日立公司）。

1.2 GS-SnO2-Au复合材料的制备

通过一种简单的化学方法合成GS-SnO2-Au复合材料［2］：将50 mL 0．01%的HAuCl4加热至沸腾，加入0．75 mL 1%柠檬酸钠，保持沸腾15 min，冷却至室温，得到金纳米颗粒溶液。将15 mg GS-SnO2分散于20 mL 25%的PDDA溶液中，搅拌30 min，再加入60 mL金纳米颗粒溶液，继续搅拌过夜，得到GS-SnO2-Au黑色悬浮液。采用离心分离、干燥、研磨制得黑色粉末。1 mg黑色粉末经超声波处理后均匀分散于1 mL水溶液中，得到1 mg/mL GS-SnO2-Au溶液。

1.3 Pt@CuO-MWCNTs的制备

将0．5 g MWCNTs加入3．0 mol/L HNO3和2．0 mol/L H2SO4（体积比3∶1）混合溶液中，去除MWCNTs中的金属氧化物，40℃下超声3 h。经过预处理的MWCNTs在室温下冷却，用水冲洗至中性后，在室温下干燥。

将16 mg Cu（CH3COO）2·H2O溶于5 mL水中，搅拌下加入0．1 mL 25%的NH4OH溶液，并将10 mg上述预处理的MWCNTs分散于溶液中，反应17 h，离心分离并洗涤，在70℃真空条件下干燥。最终产物在350℃，N2保护下煅烧3 h得到CuO-MWCNTs复合材料。

采用化学还原法制备Pt@CuO-MWCNTs［18］：将CuO-MWCNTs复合材料分散于5 mL 5 mg/mL的K2PtCl4水溶液中。缓慢加入0．1 mol NaBH4和1 mol NaOH的混合溶液还原Pt盐。在pH 3．2盐酸溶液中，100℃冷凝回流12 h，离心分离洗涤干燥后，得到Pt@CuO-MWCNTs复合材料，35℃真空中干燥12 h。4 mg Pt@CuO-MWCNTs超声分散于1 mL水中备用。

1.4 制备免疫探针Pt@CuO-MWCNTs/Ab2

将2 mg Pt@CuO-MWCNTs加 入1 mL 10 μg/mL的Ab2溶 液中，4℃下 振荡 孵 化12 h，制 得Pt@CuO-MWCNTs/Ab2，4℃下储存备用。

1.5 免疫传感器的构建

夹心型电化学免疫传感器的组装过程如图1所示：依次用1．0、0．3、0．05 μm的Al2O3粉末抛光裸玻碳电极（GCE）。将6 μL 1 mg/mL的GS-SnO2-Au溶液滴至GCE表面并干燥。在电极表面滴加6 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，孵化1 h。接着滴加3 μL 1%的BSA溶液至电极，孵化1 h以消除非特异性结合位点。水洗涤后，将6 μL不同浓度的HBs溶液滴至电极，孵化1 h。最后，将6 μL 2 mg/mL的Pt@CuOMWCNTs/Ab2溶液滴加在电极表面完成免疫反应。

图1 铂氧化铜负载多壁碳纳米管免疫传感器的制备Fig．1 The preparation procedures of Pt@CuO-MWCNTs immunosensor

1.6 实际样品预处理及乙肝表面抗原检测

血清样本由医院提供。通过以下步骤对人血清样品进行特殊处理：将人血清样品在4℃下静置24 h去除血细胞和其他血液沉淀物并储存于无菌管中。用PBS（pH 7．4）稀释血清样品至适当浓度，通过制备免疫传感器检测血清样本的上清液。

采用三电极系统进行电化学测量：直径4 mm的GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，通过计时电流记录电流响应，检测电压为-0．4 V，测量均在pH 7．4的PBS中进行，磁力搅拌下电流稳定后，用微量注射器向PBS中注入10 μL 5 mmol/L的H2O2溶液，记录电流变化。

2 结果与讨论

2.1 GS-SnO2-Au和Pt@CuO-MWCNTs的表征

分别对GS-SnO2和GS-SnO2-Au进行表征。通过高倍透射电镜表征图可看出SnO2纳米颗粒均匀地镶嵌在石墨烯表面，其晶格间距为0．33 nm，对应金红石相SnO2的生长方向。SnO2纳米粒子的粒径为3~5 nm，其表面带正电荷，可通过物理吸附、静电结合或电荷转移与石墨烯相互结合（图2A）。通过透射电镜图可观察到GS-SnO2的形貌呈明显的二维层状结构，金纳米颗粒大小均匀，且均匀负载在GS-SnO2表面（图2B）。

图2 GS-SnO2的高倍透射电镜（A）及GS-SnO2-Au的透射电镜图（B）Fig．2 HRTEM image of GS-SnO2（A），and TEM image of GS-SnO2-Au（B）

采用相同浓度的MWCNTs、CuO-MWCNTs和Pt@CuO-MWCNTs分别修饰GCE，并在电化学工作站上检测催化H2O2获得的计时电流。如图3A所示，CuO-MWCNTs（曲线b）的催化能力是MWCNTs（曲线a）的20倍，Pt@CuO-MWCNTs（曲线c）是CuO-MWCNTs（曲线b）的2倍，表明Pt@CuO-MWCNTs的催化活性最强。通过TEM进一步观察CuO-MWCNTs和Pt@CuO-MWCNTs的形态（图3B、C），可以观察到CuO纳米颗粒的粒径为15~20 nm，镶嵌在多壁碳纳米管内部，图3C内插图为Pt@CuO-MWCNTs的高倍透射电镜图，可观察到Pt纳米颗粒镶嵌在管壁的外表面。图4为Pt@CuO-MWCNTs的能谱图，图中可明显观察到C、O、Cu、Pt的元素峰，其中元素含量百分比分别为C（81．35%）、O（7．30%）、Cu（9．88%）、Pt（1．47%），研究结果表明，Pt和CuO已负载在MWCNTs上。

图3 MWCNTs（a），CuO-MWCNTs（b）和Pt@CuO-MWCNTs（c）的计时电流图（A）；CuO-MWCNTs（B）的透射电镜图；Pt@CuO-MWCNTs的透射电镜图（C）及Pt@CuO-MWCNTs的高倍透射电镜图（D）Fig．3 Amperometric responses of MWCNTs（a），CuO-MWCNTs（b）and Pt@CuO-MWCNTs（c）（A），TEM images of CuO-MWCNTs（B）and Pt@CuO-MWCNTs（C），HRTEM image of Pt@CuO-MWCNTs（D）

图4 Pt@CuO-MWCNTs的能谱图Fig．4 Energy spectrum of Pt@CuO-MWCNTs

2.2 免疫传感器的表征

以逐层修饰的玻碳电极作为工作电极，在5 mol/L K3［Fe（CN）6］电解液中采用循环伏安法（CV）表征了免疫传感器的组装（如图5A）。首先在GCE（曲线a）上修饰GSSnO2-Au（曲线b），电极的氧化还原峰增强，接着分别在电极表面修饰Ab1（曲线c）、BSA（曲线d）和HBs（曲线e），由于生物活性物质阻碍了电子转移，使得氧化还原峰电流逐渐下降。最后在电极表面修饰Pt@CuO-MWCNTs/Ab2（f），峰电流再次下降，表明免疫传感器已成功构建。

采用电化学阻抗谱法研究了层层修饰电极的电子转移能力，以表征电化学免疫传感器的组装过程。在0．1~105Hz记录交流阻抗谱图，高频区域为半圆，表示电子转移电阻（如图5B）。随着GS-SnO2-Au（曲线b）修饰在GCE（曲线a）上，电阻有所减少，当Ab1（曲线c）、BSA（曲线d）、HBs（曲线e）依次修饰在电极上时，由于大量生物活性物质的叠加阻碍了电子转移，电极的阻抗进一步增大。最后，在电极表面修饰Pt@CuO-MWCNTs/Ab2，Ab2进一步抑制电子转移，基于Pt@CuO-MWCNTs的良好导电性，使电极的阻抗增幅减少（曲线f），表明免疫传感器已成功构建。

图5 免疫传感器构建的循环伏安图（A）及交流阻抗图（B）Fig．5 CV curves（A）and Nyquist diagrams（B）of the immunosensor

2.3 实验条件的优化

为获得最佳的电化学检测信号，对pH值、GS-SnO2-Au及Pt@CuO-MWCNTs质量浓度进行优化。由于强酸（碱）性环境会破坏抗原和抗体的活性，配制了pH 5．0~8．0的系列PBS缓冲溶液。图6A显示，在pH 5．0~7．4范围内，电流信号逐渐上升并达到最大值，之后随pH值的增大其电流信号下降。因此实验选择最佳pH值为7．4。

如图6B所示，在0．5~1．0 mg/mL范围内，随着GS-SnO2-Au质量浓度的增加，Ab1的固载量增加，与抗原免疫结合的探针量增加，进而电流信号也随之增加。但随着GS-SnO2-Au质量浓度从1 mg/mL增加到2 mg/mL时，界面电子转移电阻增大，电流逐渐减小。因此，实验选择GS-SnO2-Au的最佳质量浓度为1 mg/mL。图6C所示，电流信号随Pt@CuO-MWCNTs质量浓度的增加而增加，直至2 mg/mL时达到最大值，当质量浓度超过2 mg/mL时，电流信号减小。因此，实验选择Pt@CuOMWCNTs的最佳质量浓度为2 mg/mL。

图6 pH值（A），GS-SnO2-Au（B）及Pt@CuO-MWCNTs（C）质量浓度对电流信号的影响Fig．6 Effects of pH value（A），concentration of GS-SnO2-Au（B）and Pt@CuO/MWCNTs（C）on the immunosensor error bar=5%

2.4 免疫传感器检测HBs的工作曲线

在最佳实验条件下，该电化学免疫传感器检测一系列 不 同 质 量 浓 度（0、0．001、0．01、0．1、1、50、100 ng/mL）HBs，图7为获得的计时电流曲线图。结果显示，检测HBs三次注入H2O2引起电流变化的均值（Y）与其质量浓度的对数值（X，ng/mL）呈线性关系，其标准曲线如图7插图，线性方程为Y=127．51+11．14X（r2=0．996 9），线性范围为0．001~100 ng/mL，检出限（S/N=3）为0．33 pg/mL。

图7 系列质量浓度HBs的计时电流曲线图Fig．7 Amperometric I-t current curve of HBs at different concentrations insert：calibration plot between I-t current and the logarithm values of HBs concentrations

2.5 不同方法的比较

将Pt@CuO-MWCNTs免疫传感器与其他检测HBs的免疫传感器进行对比。结果显示，Pt@CuOMWCNTs的多重放大信号作用使得该免疫传感器的检出限明显低于其它方法（见表1），可实现HBs的灵敏检测。

表1 Pt@CuO-MWCNTs免疫传感器与其他电化学传感器的对比Table 1 Comparison of Pt@CuO-MWCNTs immunosensor and the other sensors

2.6 重现性、选择性与稳定性

相同条件下平行制备5支免疫传感器，在最佳实验条件下检测1 ng/mL HBs，测得检测结果的相对标准偏差（RSD）为4．7%，说明该免疫传感器具有较好的重现性。

以癌症胚胎抗原（CEA）、鳞状细胞癌抗原（SCCA）、葡萄糖、维生素C、前列腺蛋白抗原（PSA）和BSA为干扰物，分别测定了1 ng/mL HBs溶液中加入100 ng/mL干扰物的电流信号。结果显示，干扰物引起的电流变化小于无干扰物时电流的5%，说明该免疫传感器的选择性良好。

同一组免疫传感器储存于4℃的PBS中，每隔5 d测量并记录一次电流信号。20 d后，免疫传感器的电流信号变化不大，仍能保持初始电流的95．1%，表明该免疫传感器具有良好的稳定性。

2.7 实际样品的分析

在最佳实验条件下，设计的免疫传感器采用标准加入法检测血清样品中HBs的浓度，并与酶联免疫吸附法（ELISA）进行比较（见表2）。结果表明，该方法的回收率为99．8%~100%，相对标准偏差（RSD，n=5）为1．1%~1．5%，表明该免疫传感器可用于实际样品的检测。

表2 实际样品中HBs的检测Table 2 The detection of HBs in serum sample

3 结论

本文以GS-SnO2-Au为基底，Pt@CuO-MWCNTs为标记物，构建了一种夹心型电化学免疫传感器用于HBs的灵敏检测。GS-SnO2-Au可有效固定捕获抗体，Pt@CuO-MWCNTs的协同放大催化作用提高了检测信号强度，增强了免疫传感器的灵敏度。该方法的检测线性范围宽、检出限低，且重现性、选择性及稳定性良好，具有广阔的应用前景。