气相色谱-串联质谱法测定植物源化妆品中53种农药残留

梁梓洋，梁梓豪，马叶芬，罗辉泰，黄 芳，吴惠勤

（广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070）

近年来，随着社会经济的发展，人们的生活水平稳步提高，对化妆品的要求也随之不断提高。《中华人民共和国国民经济和社会发展第十四个五年规划和2035年远景目标纲要》明确指出，要开展中国品牌创建行动，保护发展中华老字号，提升自主品牌影响力和竞争力，率先在化妆品、服装、家纺、电子产品等消费品领域培育一批高端品牌［1］，这标志着我国化妆品行业科技引领的高质量发展时代已到来。在市场潮流的推动下，绿色化及具有特定功效的化妆品日益受到青睐，许多化妆品以添加天然植物成分为亮点，植物提取物在化妆品中的应用日趋广泛［2］。植物提取物的引入不仅可为化妆品带来独特香味，其活性成分还具有滋养、修护、祛痘等特定功效［3］，因此植物提取物的正确应用能为化妆品带来更好的美容护肤效果［4］，具有广阔的应用前景。但由于环境污染或种植过程中非法使用农药等问题［5-6］，在化妆品引入植物提取物原料时会带来农药残留的安全风险。

由农药残留引起的化妆品安全问题已逐渐得到国内外研究者的高度重视。早在2010年，国家食品药品监督管理总局在《关于印发化妆品中可能存在的安全性风险物质风险评估指南的通知》中指出，使用植物来源原料的化妆品应说明其农药残留的情况。2013年，欧盟在化妆品法规EC1223/2009中明确指出艾氏剂、狄氏剂等农药属于化妆品中的禁用组分［7］；我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》中明确规定多种农药成分为化妆品的禁用组分［8］。2020年，国家市场监督管理总局发布了《含植物提取物类化妆品中55种禁用农药残留量的测定》（GB/T 39665-2020），为植物源化妆品的农药残留检测提供了依据［9］。

目前，化妆品中农药残留的测定方法主要有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法等［7，10-12］。GB/T 39665-2020中使用气相色谱-质谱法及液相色谱-串联质谱法进行测定，前者可测定35种禁用农药。然而植物源化妆品基质比传统化妆品更为复杂，使用气相色谱-质谱法的选择离子扫描模式（SIM）也难以避免干扰。而串联质谱（MS/MS）可对母离子进行选择性分离，利用其产生的子离子进行检测，可提高分辨能力并大大降低背景值，采用气相色谱-串联质谱法的选择反应监测模式（SRM）可在复杂基质情况下获得更好的选择性和抗干扰能力［13-15］，从而提高分析的灵敏度，近年来被越来越多地用于多种基质的禁用农药残留检测中［16-19］。例如《中国药典（2020年版）》［20］中，规定使用气相色谱-串联质谱法及液相色谱-串联质谱法对中药材中33种禁用农药进行测定。植物源化妆品的基质复杂程度更高，但尚未见使用气相色谱-串联质谱法测定其农药残留的报道。本文选取GB/T 39665-2020和《中国药典（2020年版）》中涉及的53种禁用农药，以水基型的精华液和非水基型的膏霜2种代表性样品为研究对象优化样品前处理方法，建立了植物源化妆品中53种禁用农药残留的气相色谱-串联质谱测定方法。该方法样品前处理简单快速，方法灵敏度和选择性高，重复性好，适用于化妆品中多种农药残留的同时、快速检测，为保障化妆品质量安全和促进我国化妆品的高质量发展提供了技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TRACE 1300-TSQ 9000，美国Thermo Fisher Scientific公司）；超声波清洗器（东莞市超声波设备有限公司）；电子天平（美国Sartorious公司）；涡旋振荡器（德国IKA公司）；QB-600型高速振荡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；氮吹浓缩仪（青岛聚创环保集团有限公司）；冷冻高速离心机（湘仪集团）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（300 mg/3 mL，美国Agilent公司）；0．22 μm有机相滤膜（美国Agilent公司）。

1.2 材料与试剂

53种农药对照品（坛墨质检标准物质中心）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色谱纯，德国Merck公司）；实验用水为二次蒸馏水；氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备溶液与工作溶液的配制分别准确称取适量待测农药对照品，用乙腈配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。使用时，根据需求用乙腈稀释成不同质量浓度的标准工作溶液。

1.3.2 空白样品基质溶液与基质混合标准工作溶液的配制称取经测定不含目标待测物的空白样品0．5 g，按照样品前处理方法制得空白样品基质溶液。经氮气浓缩后，加入不同质量浓度的标准工作溶液后定容，得到基质混合标准工作溶液。

1.4 样品前处理

液体样品（精华液、化妆水及原液等）：称取试样0．5 g（精确至0．000 1 g）于15 mL离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液稀释并混匀，随后加入5 mL乙腈，涡旋混合30 s后以1 120次/min的频率振荡提取10 min，以10 000 r/min离心3 min。取上清液于另一15 mL离心管中，剩余部分用5 mL乙腈再提取1次，合并两次提取液，于35℃水浴下氮吹浓缩至约3 mL。浓缩后的提取液过EMR固相萃取柱净化。收集洗脱液于35℃水浴下氮吹至约0．3 mL，用乙腈定容至0．5 mL，经有机相滤膜过滤后待测定。

膏霜和乳液样品（面霜、精华霜及护发乳等）：称取试样0．5 g（精确至0．000 1 g）于15 mL离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液后涡旋混合1 min，超声处理5 min使样品充分分散。加入5 mL乙腈于上述离心管中，涡旋混合30 s后以1 120次/min的频率振荡提取10 min，以10 000 r/min离心3 min。取上清液于另一15 mL离心管中，剩余部分用5 mL乙腈再提取1次，合并两次提取液，于35℃水浴下氮吹浓缩至约3 mL。置于-24℃下冷冻20 min，于4℃下以10 000 r/min离心2 min，上清液过EMR固相萃取柱净化。收集洗脱液于35℃水浴下氮吹至约0．3 mL，用乙腈定容至0．5 mL，经有机相滤膜过滤后待测定。

1.5 实验条件

1.5.1 色谱条件色谱柱：Agilent VF-17ms毛细管柱（30 m×0．25 mm×0．25 μm）；色谱柱升温程序：70℃保持2 min，以25℃/min升至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升至280℃保持10 min；载气：氦气（纯度≥99．999%）；载气流速：1．0 mL/min；进样口温度：260℃；进样量：1 μL；进样方式：脉冲不分流进样，脉冲压力为150 kPa，0．75 min后打开分流阀和隔垫吹扫。

1.5.2 质谱条件电子轰击电离源（70 eV）；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；碰撞气：氩气；扫描方式：选择反应监测（SRM）模式，时间窗口为保留时间±1．0 min。53种农药的定性定量离子对、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 53种农药的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of 53 pesticides

（续表1）

2 结果与讨论

2.1 仪器分析条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择分别考察了弱极性的DB-5MS（30 m×0．25 mm×0．25 μm）和中等极性的VF-17ms（30 m×0．25 mm×0．25 μm）两种色谱柱的分离效果。实验表明，两种色谱柱均能使53种农药实现基线分离，对于互为异构体的农药，如β-六六六/γ-六六六和p，p＇-滴滴滴/o，p＇-滴滴滴，在VF-17ms色谱柱上能够取得更满意的分离度。因此，本实验选择VF-17ms柱作为色谱柱。

2.1.2 质谱条件的优化使用目标物的混合标准工作溶液，对53种农药进行质谱全扫描分析，在各化合物的一级质谱中选取丰度较高的分子离子峰或质荷比较大的基峰作为母离子，对各化合物的母离子施加一定的碰撞能量获得其二级质谱，选取丰度较高且质荷比较大的碎片离子作为子离子。通过优化碰撞能量使53种农药的离子对强度达到最大值，从而确定各化合物最优的质谱参数，如“1．5．2”所示。53种农药在优化条件下的SRM总离子流图见图1。

图1 53种农药在选择反应监测模式扫描下的总离子流图Fig．1 Total ion chromatograms of 53 pesticides using SRM mode peak numbers 1 to 53 are corresponding with the compounds shown in Table 1

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择由于化妆品基质较复杂，不同种类的农药性质也存在差异，提取效率易受到基质的影响，因此需选择提取效率高且对基质提取较少的溶剂作为提取溶剂。常见的提取溶剂主要有乙腈、丙酮和乙酸乙酯等［21］。本文以精华液和膏霜样品为研究对象，考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯对目标物的提取效率（见表2）。对于部分膏霜样品，需先加入饱和氯化钠溶液进行破乳和分散，提高提取溶剂的提取效率；对于精华液样品，加入饱和食盐水可降低样品的黏度，同时可使有机相与水相更好地分层。结果表明，3种提取溶剂均能从精华液和膏霜两种基质中提取53种目标农药，但由于丙酮与乙酸乙酯的极性相对较小，在提取目标化合物的同时也提取了膏霜样品中的大量油脂，会对进样口和色谱柱造成污染［22］。而乙腈的极性适中，且能够与饱和氯化钠溶液较好地分层，对53种目标化合物的提取效率也较高，因此选择乙腈作为提取溶剂。

表2 不同溶剂对53种农药的提取效率Table 2 Extraction efficiencies of 53 pesticides with different solvents

2.2.2 提取方式的选择比较了涡旋提取和振荡提取两种方式的提取效果。结果表明，以乙腈作为提取溶剂，采用涡旋提取时，53种农药在精华液和膏霜样品中的平均回收率分别为82．3%~104%和62．8%~102%；当采用振荡提取时，53种农药在精华液和膏霜样品中的平均回收率分别为83．1%~102%和79．0%~108%，可见振荡提取的效果较好。由于精华液和膏霜样品具有一定的黏度，即使加入饱和氯化钠溶液进行稀释，其黏度仍较大，导致提取溶剂与样品难以充分接触。相比之下，利用振荡提取可使两相充分接触，获得相对较好的提取效率。综合考虑，选择乙腈振荡提取作为提取方式。

2.3 样品净化方式的选择

由于膏霜样品中含有大量油脂，即使选择极性较大的乙腈作为提取溶剂，也不可避免地共提取出一部分油脂，而过多的油脂会使固相萃取柱的填料饱和，影响提取液的净化效果，并对进样口和色谱柱造成污染。由于油脂在低温条件下易从乙腈中析出［23］，因此选择在-24℃下冷冻处理20 min，以去除乙腈提取液中的油脂。为考察冷冻除脂对53种农药回收率的影响，比较了冷冻处理前后的平均回收率。结果表明，膏霜样品经冷冻处理前、后的回收率分别为58．5%~118%和70．9%~113%，说明冷冻处理能够去除部分油脂而起到净化作用。同时比较了精华液样品在冷冻处理前后回收率的变化，结果发现处理前、后的回收率相差甚微，因此对于精华液样品可省略该步骤。

尽管冷冻除脂可起到一定的净化效果，但乙腈提取液中仍含有一定量的油脂，而EMR-Lipid固相萃取柱可以选择性地从高油脂含量样品中保留脂质［24-25］，将油脂从提取液中分离，从而达到净化效果。为进一步消除油脂对后续测定的影响，选择该固相萃取柱进行净化。膏霜样品的乙腈提取液经冷冻除脂后，以EMR-Lipid柱进行净化前、后53种农药的平均回收率分别为68．7%~114%和76．6%~104%，说明EMR-Lipid柱能够减弱基质的影响。此外，考察了EMR-Lipid固相萃取柱对精华液样品乙腈提取液的净化效果，处理前、后53种农药的平均回收率分别为76．0%~94．3%和82．8%~101%，表明EMR-Lipid柱起到了一定的净化效果。综上，选择冷冻除脂结合EMR-Lipid固相萃取柱作为样品净化方式。

2.4 基质效应

质谱分析中存在的基质效应（ME）会对测定结果造成较大影响。分别以精华液和膏霜基质为对象，考察53种农药在这两类样品中的基质效应。选取经测定不含目标待测物的空白样品，将经提取和净化后配制的基质匹配标准溶液与使用乙腈配制的相同质量浓度的标准溶液同时按照“1．5”条件进行分析，得到标准曲线，并按公式计算基质效应：ME（%）=100%×（A-B）/B［7］。式中，A和B分别为基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。当ME＞0时，为基质增强效应；当ME＜0时，为基质抑制效应。

53种农药的响应值在基质溶液中均有不同程度的增大，在精华液样品中的平均ME值为21．4%~130%，在膏霜样品中的平均ME值为25．5%~148%，均表现为基质增强效应。为减弱基质效应对目标化合物的影响，样品采用基质匹配标准曲线进行定量。

2.5 线性范围、检出限与定量下限

采用基质匹配的外标标准曲线法进行定量分析，按照“1．5”条件对系列基质匹配标准工作溶液进行测定，以各化合物的定量离子对峰面积（y）对各自的质量浓度（x）进行回归分析，得到各组分的回归方程与相关系数。并在空白样品中添加一定浓度的53种农药混合标准溶液，测定结果以3倍信噪比为检出限（LOD），10倍信噪比为定量下限（LOQ）。结果表明，53种农药在两种化妆品基质中具有良好的线性关系，相关系数（r2）为0．996 1~0．999 9，LOD为0．01~0．02 mg/kg，LOQ为0．02~0．05 mg/kg（见表3）。

表3 53种农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 53 pesticides

2.6 回收率与相对标准偏差

以精华液（水基样品）和膏霜（非水基样品）两种化妆品作为代表性基质，选取经测定不含目标待测物的空白样品进行加标回收率和精密度实验。在0．05 mg/kg加标水平下进行6次重复实验，以相应的基质匹配标准曲线计算53种农药的回收率和相对标准偏差（RSD）。由表4可知，53种农药在精华液样品中的平均回收率为84．5%~102%，RSD为1．1%~4．9%；在膏霜样品中的平均回收率为77．1%~105%，RSD为0．50%~4．0%，能够达到GB/T 39665-2020的要求，满足实际检测需要。

表4 精华液与膏霜样品中53种农药的加标回收率及相对标准偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 53 pesticides in essence and cream sample

2.7 实际样品检测

使用本方法对30个植物源化妆品进行检测，检出2个阳性样品，在1个含人参提取物的膏霜样品和另1个含金银花提取物的液体样品中，分别检出0．06 mg/kg的六氯苯和0．04 mg/kg的氟虫腈，阳性样品的总离子流图如图2所示。尽管在化妆品中由植物提取物所引入的农药残留量一般较低，但由于大部分化妆品属于日常使用的生活必需品，而在长期低剂量暴露于包括六氯苯在内的有机氯农药及有机磷农药情况下，会带来生殖毒性及神经毒性等潜在安全风险［26-28］，因此化妆品生产企业应重视植物提取物原料中农药残留的控制。

图2 检出六氯苯（A）和氟虫腈（B）的阳性样品的总离子流图Fig．2 Total ion chromatograms of hexachlorobenzene（A）and fipronil（B）in positive samples

3 结论

本研究采用乙腈提取，经过冷冻除脂-EMR固相萃取净化，结合高灵敏度的GC-MS/MS检测技术，实现了植物源化妆品中53种常见农药的快速定性定量分析。该方法具有良好的灵敏度、准确度和精密度，前处理简便快速，能够满足实际检测的要求，为植物源化妆品的质量控制提供了技术支撑。利用本方法在采集的30个植物源化妆品中检出2个阳性样品，提示该类化妆品中农药残留的问题不容忽视，生产企业与政府相关部门应对该问题予以更高的重视，以促进我国化妆品行业高质量发展。