重组生长激素预处理对卵巢低反应患者促排卵结局及子宫内膜容受性的影响

杨元菁，施晓鋆*，王聪

(1.贵州医科大学，贵阳 550004；2.贵阳市妇幼保健院，贵阳 550003)

有研究数据表明，2007—2020年间，我国不孕症发病率已上升至18%[1]。且随着“二胎政策”及“三胎政策”的调整，符合生育政策的女性中高龄妇女占比越来越多。一项调查报告显示在1 674名年龄≥35岁的女性中，有生育意愿的占78.43%[2]。年龄是卵巢低反应(poor ovarian response，POR)发病的第一相关因素，POR在不孕患者中的发病率逐渐升高。随着社会经济发展、不良生活习惯增加等因素，许多年轻的不孕患者也出现POR。辅助生殖助孕治疗中，许多POR患者在调整了促排卵方案后，仍表现为Gn用量大、获卵数少、周期取消率高，不能获得理想的促排卵结局，加重了患者的经济和精神压力，也给临床工作者带来了难题。重组生长激素(r-GH)除了用于治疗发育障碍及烧伤外，近年来的研究发现其对生殖系统也有一定的作用，主要可从胚胎和子宫内膜容受性两方面来影响助孕结局[3-4]。通过促排卵治疗可获得一定数量的卵子，经过体外受精后获得胚胎。促排卵结局可通过获卵数、MⅡ卵数及优质胚胎率等数据来评价。同源框基因A10(homeboxA10gene，HOXA10)在着床种植窗口期呈表达高峰，与子宫内膜容受性及胚胎着床过程有一定相关性[5]，可作为评价子宫内膜容受性的可靠指标之一。目前关于r-GH应用于POR患者的临床效果仍存在争议。本研究通过对照实验观察r-GH对POR患者促排卵结局及子宫内膜容受性的改善情况，以期为临床治疗提供一定的参考。

资料与方法

一、研究对象及分组

选取2020年10月至2021年12月就诊于贵阳市妇幼保健院生殖中心的75例POR患者为研究对象。纳入标准：(1)符合博洛尼亚POR诊断标准[3]；(2)年龄小于38岁；(3)体质量指数(BMI)范围18.0～29.0 kg/m2；(4)上一周期促排卵方案采用高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案；(5)月经周期规律；(6)采用IVF授精方式。排除标准：(1)存在脑垂体疾病或内分泌疾病(如甲亢、甲减、糖尿病、高泌乳素血症等)；(2)同时采用了其他改善卵巢储备功能的措施，包括口服脱氢表雄酮、服用中药、进行针灸等；(3)合并多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、输卵管积水、子宫内膜息肉、宫腔粘连、粘膜下肌瘤等；(4)GH使用禁忌者；(5)夫妇双方至少一方核型异常；(6)男方存在少、弱、畸形精子症或无精子症等。

将符合上述标准的75名受试者按1∶2的比例随机分为对照组(不给予r-GH预处理，25例)和预处理组(给予r-GH预处理，50例)；两组患者均只纳入首个促排卵周期的临床资料。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有入组患者均签署知情同意书。

POR的诊断：根据博洛尼亚标准[6]，符合以下3条中的两条即可诊断为POR：(1)大于或等于40岁或存在任何其他高危因素；(2)之前因卵巢反应不良取消周期，或获卵数小于3个；(3)卵巢储备功能异常：抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml或基础窦卵泡计数(AFC)<5～7个。

二、r-GH预处理及促排卵

预处理组患者在月经周期第9～10天行B超检查监测排卵，排卵后7～9 d在子宫内膜种植窗口期予r-GH注射液(赛增，15 U/支，长春金赛药业)2 U/d肌肉注射，使用4～6周，直至第2次月经周期第2～3天启动PPOS方案，并在启动日将r-GH剂量增加至4 U/d直至扳机日。本周期仍然采用PPOS方案促排卵，具体操作为：口服醋酸甲羟孕酮(安宫黄体酮，2 mg/片，浙江仙琚制药)8～10 mg/d，予注射用尿促卵泡素(丽申宝，75 U/支，珠海丽珠制药)225～300 U/d肌肉注射。当≥1个卵泡直径>20 mm或者≥3个卵泡直径>18 mm时，皮下注射醋酸曲普瑞林注射液(1 ml∶0.1 mg，长春金赛药业)1 ml及肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，2 000 U/支，珠海丽珠制药)2 000 U双扳机。

对照组患者不予r-GH预处理，直接启动PPOS方案。

扳机后34～36 h在阴道超声引导下取卵。取卵后4～6 h行常规IVF，受精卵培养至第3天或第6天将卵裂期胚胎或囊胚采用快速冷冻法保存于液氮中备用。

三、子宫内膜组织中HOXA10表达检测

1.主要试剂及仪器：苏木素染液(LM10N13，北京百灵威科技有限公司)、DAB试剂盒(ZLI-9018，北京中杉金桥生物有限公司)、山羊血清(SP9001，北京中杉金桥生物有限公司)、兔多克隆一抗HOXA10(Bs-2502R，北京博奥生物技术有限公司)、山羊抗兔二抗(SP9001，北京中杉金桥生物有限公司)、Ultrapure RNA Kit(CW0581M，50250，北京康为世纪公司)，HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(Q221-01，7E220E8，南京Vazyme生物科技股份有限公司)、包埋机(BMJ-Ⅲ，常州中威电子仪器厂)、实时荧光PCR仪(QuantStudio1，AppliedBiosystems公司，美国)、低温离心机(C2500，湖南湘仪实验仪器厂)，一次性使用S型宫腔组织吸引管(立可灵，TY-C3.1/3-1S，上海家宝医学保健科技有限公司)。

2.样本采集：预处理组中有10名患者自愿接受子宫内膜容受性检测并签署知情同意书。在使用r-GH预处理前的子宫内膜种植窗口期，通过一次性使用S型宫腔组织吸引管采集子宫内膜组织，r-GH预处理4～6周后，下一个月经周期的子宫内膜种植窗口期再次留取子宫内膜组织(操作同前)。将子宫内膜样本分为2份，各约2 g，分别进行福尔马林固定及0～2℃冷藏保存。

3.子宫内膜组织HE染色：福尔马林固定组织后经全自动脱水机脱水，石蜡包埋后制作切片(厚度5 μm)，放置45℃恒温箱中烘干。苏木素染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化30 s，充分水洗，返蓝；伊红染色2 min，自来水冲洗，脱水封片。在显微镜下观察并进行图像采集。

“我们不是一个人在战斗！”省林科院副研究员陈景震幽默地说。他定点服务的是宜章县白石渡镇。那里，已经建起近两千亩板栗林，陈景震此行的目的是针对板栗林产量下降和落果的问题进行诊断，通过改良和科学种植，届时，板栗林的亩产有望从目前的60公斤提高到200公斤。

4.免疫组化法检测HOXA10蛋白表达：切片制作同HE染色。使用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，滴加一抗后4℃过夜，PBS冲洗5 min×3次；滴加二抗后37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次；DAB显色，复染细胞核后，脱水封片。使用三目显微摄像系统(BA400Digital，厦门麦克奥迪实业集团有限公司)进行图像采集，以细胞膜或细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒为HOXA10表达阳性；使用Halo数据分析系统(Indica labs，美国)计算每张图像中的阳性面积占比(阳性面积/总面积×100%)。

5.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HOXA10 mRNA表达：将冷藏保存的子宫内膜标本加入液氮研磨，提取总RNA，鉴定后逆转录为cDNA，进行qRT-PCR扩增反应。引物由生工生物工程公司(上海)设计并合成，HOXA10基因的上游引物：5′-GGCAAAGAGTGGTCGGAAGA-3′，下游引物：5′-GTGGACGCTGCGGCTAAT-3′；GADPH上游引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，下游引物：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。PCR反应条件：55℃ 5 min，95℃ 5 min预变性，95℃ 10 s变性，60℃ 30 s退火；重复45个循环。使用Thermo Scientific PikoReal软件分析各样本的CT值，通过2-ΔΔCT公式计算HOXA10相对mRNA表达水平(其中CT为循环阈值)。

四、观察指标

比较两组患者的一般资料(年龄、不孕年限、基础性激素水平等)、促排卵实验室指标(Gn总量和天数、AFC、HCG日内膜厚度、获卵数等)、胚胎发育指标(2PN率、优质胚胎率)，以及HE染色的镜下特点、HOXA10在mRNA和蛋白水平的表达。其中2PN率=正常受精卵母细胞数/获卵数×100%，优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵母细胞数×100%。

五、统计学分析

结 果

一、两组患者一般资料比较

对照组和预处理组患者的年龄、不孕年限、BMI、AMH、基础FSH(bFSH)、基础LH(bLH)比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料比较(-±s)

二、两组患者促排卵及胚胎发育指标比较

两组患者Gn天数、AFC、HCG日E2及内膜厚度、2PN率及优质胚胎率比较均无显著性差异(P>0.05)；预处理组患者Gn总量显著低于对照组，获卵数及MⅡ卵数显著高于对照组(P均<0.05)(表2)。

表2 两组患者促排卵及胚胎发育指标比较[(-±s)，%]

三、预处理组患者r-GH预处理前后自身对照比较

比较预处理组患者本周期(给予r-GH预处理)与上一周期(未予r-GH预处理)促排卵及胚胎发育的相关指标，结果显示本周期的Gn总量、Gn天数显著低于上一周期(P<0.05)，获卵数、MⅡ卵数及优质胚胎率显著高于上一周期(P均<0.05)(表3)。

表3 预处理组患者r-GH预处理前后自身对照比较[(-±s)，%]

四、不同年龄POR患者中r-GH预处理与否的相关指标比较

按照年龄不同将所有入组患者分为<35岁组(41例)和≥35岁组(34例)进行比较，分析年龄对r-GH预处理的影响。

1.<35岁组中对照组和预处理组相关指标比较：<35岁组中对照组和预处理组的一般情况均无显著性差异(P>0.05)(表4)。两组的Gn总量、Gn天数、AFC、HCG日E2、HCG日内膜厚度、获卵数、MⅡ卵数及2PN率、优质胚胎率比较均无显著性差异(P均>0.05)(表5)。而在预处理组自身对照数据中，行r-GH预处理的本周期中Gn天数显著低于上一周期，获卵数及MⅡ卵数显著高于上一周期(P均<0.05)(表6)。

表4 <35岁患者中对照组和预处理组一般情况比较(-±s)

表5 <35岁患者中对照组和预处理组促排卵及胚胎发育指标比较[(-±s)，%]

表6 <35岁患者预处理组r-GH预处理前后自身对照比较[(-±s)，%]

2.≥35岁组中对照组和预处理组相关指标比较：≥35岁组中对照组和预处理组的一般情况均无显著性差异(P>0.05)(表7)。预处理组的Gn天数显著低于对照组，优质胚胎率显著高于对照组(P<0.05)，其余促排卵指标均无显著性差异(P>0.05)(表8)。而在预处理组自身对照数据中，本周期的Gn天数显著低于上一周期，获卵数、MⅡ卵数及优质胚胎率显著高于上一周期(P均<0.05)(表9)。

表7 ≥35岁患者中对照组和预处理组一般情况比较(-±s)

表8 ≥35岁患者中对照组和预处理组促排卵及胚胎发育指标比较[(-±s)，%]

表9 ≥35岁患者预处理组r-GH预处理前后自身对照比较[(-±s)，%]

五、子宫内膜组织r-GH预处理前后HE染色镜下特点比较

由子宫内膜组织功能层HE染色结果(图1)可见，给予r-GH预处理前后均可见子宫内膜组织腺上皮细胞开始出现顶浆分泌，腺腔不规则，间质疏松水肿，螺旋小动脉增生，符合子宫内膜分泌中期特点。

A：r-GH预处理前内膜组织；B：r-GH预处理后内膜组织。镜下特点均符合子宫内膜分泌中期特点：红色箭头示腺上皮，绿色箭头示腺管腔，黄色箭头示血管腔，蓝色箭头示间质。图1 子宫内膜组织HE染色(×100)

六、r-GH预处理前后HOXA10表达情况

1.免疫组化法检测HOXA10蛋白表达情况：r-GH预处理前后子宫内膜腺上皮细胞质内及细胞间质均可见HOXA10蛋白棕黄色或黄色阳性表达，提高放大倍数后肉眼可见r-GH预处理后HOXA10蛋白阳性表达较多(图2)；使用Halo数据分析系统计算每张图像的阳性面积占比，结果显示使用r-GH预处理后的子宫内膜中HOXA10蛋白表达阳性面积占比显著高于预处理前(P<0.05)(表10)。

A：r-GH预处理前内膜组织(×100)；B：r-GH预处理后内膜组织(×100)；C：r-GH预处理前内膜组织(×400)；D：r-GH预处理后内膜组织(×400)。镜下可见子宫内膜腺上皮细胞质内及细胞间质HOXA10蛋白阳性表达；黑色箭头示苏木素染色为蓝色的细胞核，红色箭头示棕黄色或黄色的HOXA10蛋白表达。图2 免疫组化法检测子宫内膜腺上皮细胞HOXA10蛋白表达情况

2.qRT-PCR检测HOXA10 mRNA表达情况：qRT-PCR溶解曲线显示HOXA10及内参GAPDH均可特异性扩增，扩增曲线显示r-GH预处理后的目标基因表达曲线率先升高并达到平台期(图3、4)。计算mRNA相对表达量后进行统计分析发现，r-GH预处理后子宫内膜中HOXA10 mRNA表达量显著高于预处理前(P<0.05)(表10)。

图3 GAPDH溶解曲线及扩增曲线

图4 HOXA10溶解曲线及扩增曲线

表10 免疫组化和qRT-PCR检测r-GH预处理前后HOXA10表达情况(-±s)

讨 论

目前国内外文献报道的POR发病率为5.6%～35.1%[7]，其具体病因并不明确，多认为与年龄、免疫因素、遗传因素、卵巢手术、环境因素及放化疗等有关，其中年龄为主要因素。随着年龄增长窦卵泡逐渐消耗，卵巢储备能力显著下降[8]，表现为AMH降低、基础FSH升高、AFC减少及获卵数减少等；另一方面随着氧自由基的堆积，卵子质量也逐渐下降，促排卵周期中可表现为MⅡ卵数少、2PN率低、优质胚胎率低等。辅助生殖助孕治疗的结局主要跟“种子”及“土壤”两大因素相关，即胚胎质量和子宫内膜容受性。对于上一促排周期发生POR和促排卵前评估为POR的患者，进入促排卵周期前通常采用一些辅助治疗方法，如应用脱氢表雄酮、辅酶Q10及GH等。GH可以改善卵子和胚胎质量以及子宫内膜容受性，最终改善辅助生殖结局。有meta分析表示GH可提高POR患者的获卵数、MⅡ卵数及可移植胚胎数，减少Gn使用总量及使用时间，改善助孕结局[9]。本研究结论与之类似，我们在Gn启动日前约6周(从自然月经周期分泌中期到第2次月经周期开始启动促排方案)开始使用r-GH，这是小窦卵泡发育的阶段，也是线粒体增殖、颗粒细胞发育的启动及窦卵泡对激素敏感的阶段，在这个时期应用r-GH预处理有助于始基卵泡的激活与招募，提高卵母细胞发育能力；本研究中预处理组患者的获卵数、MⅡ卵数及优质胚胎率较对照组均显著增加(P<0.05)。生理过程中，窦状卵泡在月经周期第1～4天完成募集，因此我们在启动日添加r-GH的目的在于提高卵巢对Gn的反应性，本研究结果显示预处理组的Gn总量和Gn天数较对照组显著减少(P<0.05)。还有研究报道在促排卵前给予GH 2 U/d预处理6周能使胚胎质量得到明显改善[10]，我们的结论与之相似。但是也有研究提出了不同观点，2020年发表的两项meta分析提示GH对胚胎质量并无明显改善[11-12]。

GH的分泌量随着年龄的增加逐渐减少，35岁开始血清中GH水平明显下降，40岁之后下降更为显著[13]。因此，我们得到实验数据后又将所有入组患者按照年龄进行分组，比较各观察指标的差异，结果发现年龄≥35岁的POR患者中预处理组部分促排卵指标明显改善(Gn天数显著降低，优质胚胎率显著增高)，而<35岁患者中预处理组促排卵结局改善并不明显。不同年龄患者r-GH预处理前后的自身对照比较中，<35岁患者预处理后Gn天数显著减少，获卵数及MⅡ卵数显著增加；≥35岁患者预处理后除上述指标变化，优质胚胎率亦显著升高。我们推测其原因为年龄<35岁的患者机体内自身分泌的GH较多，GH与受体的结合接近饱和，即使添加更多的外源性GH也不能被有效利用。

还有研究提出GH对助孕结局的积极作用，不仅仅是通过对卵子数量及质量的提高实现的，甚至大部分成果应归功于对子宫内膜容受性的改善[14]。莫凤媚等[15]对因子宫内膜薄而取消移植的患者行GH宫腔内灌注，结果表明GH可改善内膜血流，对妊娠结局有积极作用。目前除了子宫内膜厚度、容积及子宫内膜下血流状态可评价子宫内膜容受性[16]外，内膜组织中HOXA10的表达也是评价子宫内膜容受性的可靠指标之一。HOXA10在子宫内膜中呈周期性表达，在种植窗口期出现表达高峰[13]，参与人类胚胎着床过程并发挥重要作用。本研究结果显示r-GH预处理后子宫内膜中HOXA10蛋白及mRNA表达明显增多，提示r-GH预处理可能对改善子宫内膜容受性有积极作用，这与之前Lan等[17]的结论相似。

但本研究仍存在一定的不足：首先，研究时长尚不充分，大部分患者因胚胎冷冻未行胚胎移植导致资料数据覆盖不完整，待进一步收集妊娠率、流产率及活产率等数据，完善相关分析。其次，纳入样本量较少，可能存在研究结果的偏倚，后续应增大样本量进行更深入的研究。

综上所述，在促排卵周期前对POR患者进行r-GH预处理可提高卵巢反应性，减少Gn使用时间及用量，增加获卵数及MⅡ卵数，提高胚胎质量，且r-GH能同时改善POR患者的子宫内膜容受性，对促排卵结局有积极作用。此外，r-GH预处理可能对年龄≥35岁的POR患者益处更大。