金银花主要活性成分及内生菌研究进展

姜茗轩，张红兵，李 冉，贾振华，3

(1.河北经贸大学,河北 石家庄 050062;2.河北省科学院生物研究所,河北 石家庄 050081；3.巨鹿县应用技术研究院，河北 巨鹿 055250)

金银花也称忍冬，最早记载于《名医别录》，是我国的传统中草药，广泛种植于河北、河南、山东、甘肃等地[1]。金银花根、茎、叶、花、种子可代谢产生酚类、黄酮类、皂苷类等活性物质，具有清热解毒、利胆健脾、保护肝脏、抗氧化、抗病毒的功效[2-3]。绿原酸和木犀草苷是其主要代谢活性物质，也是评价其质量的首要指标[4]。金银花的花通常配伍多种中药中，用于治疗呼吸道疾病、痢疾、疮疡、头痛发热等多种疾病[5-6]。除作为传统中药材外，还可应用于食品生产、畜牧养殖及化工产业。

植物内生菌可进入植物宿主维管组织，在与宿主长时间的协同进化过程中，可产生与宿主植物活性成分结构相似或相同的化合物、或激素抗生素等代谢物质。这些代谢产物可刺激宿主生成更多的活性产物或其关键酶[7-8]。植物产生有效成分是植物生理状态的最佳体现形式，是应对外界环境的胁迫手段，而内生微生物与植物可共同调控有效代谢物的产生[9]。基于内生菌易培养、有效成分获得成本低廉等优势，采用基因克隆技术对其合成途径关键酶基因进行克隆、或通过微生物发酵等技术生产目的产物，在一定程度上减少了对药材的依赖，为药物生产提供新的途径[10]。将特定功效的内生菌应用于生物防治、植物生长及有效成分的生物合成，为无公害生物菌剂的开发提供宝贵资源。本文对金银花主要活性物质绿原酸和木犀草苷活性及机理进行总结，综述了金银花内生菌筛选、内生菌应用相关方面的研究进展，以期为药用植物资源的综合利用提供参考。

1 金银花主要活性成分

金银花分为野生型和人工型，宋代《苏沈内翰良方》是最早记载人工栽培金银花的书籍[11]。目前，金银花在不同产区形成了种类丰富的人工培育品种[11-14]，见表1。绿原酸和木犀草苷作为其主要活性物质，其含量及活性程度受产地、光照、生长温度、pH、土壤条件、农药使用情况、采摘时间等多方面影响而有所不同。因此，不同产地和品种间活性成分的差异成为广大学者的研究热点。姜建辉等人[15]检测了北川引种的金银花药材，发现其绿原酸、木犀草苷含量均高于《中国药典》标准。刘天亮等人[16]对不同产地金银花活性成分进行检测，发现山东金银花中绿原酸、木犀草苷含量高于河南、河北地区。

表1 金银花特色品种及产地

图1 绿原酸化学结构图

1.1 绿原酸

绿原酸(Chlorogenic acid)又名3-咖啡酰奎宁酸，具有植物黄金的美誉，是金银花主要的有机酸类活性物质，结构如图1所示。绿原酸的天然来源主要分布在杜仲的树皮、向日籽、金银花花蕾及咖啡豆中[6]。金银花中绿原酸含量以花中最多，叶次之，茎中最少[17]。绿原酸已被证实具有抗氧化、抑菌、降脂降糖、抗肿瘤等多种活性及作用机制[18-24]，见表2。

表2 绿原酸活性及作用机制

1.2 木犀草苷

木犀草甘(Luteoloside)又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是天然黄酮类化合物，化学结构如图2。忍冬科植物的花蕾和叶片部分是木犀草苷的天然生物来源，以金银花中含量居多，是金银花质量检测的两个主要指标之一。木犀草苷主要功效为抗毒消炎、抗氧化、抗肿瘤及保护心脑血管，其活性及作用机制[25-28],见表3。

图2 木犀草苷化学结构图

表3 木犀草苷活性及作用机制

2 金银花内生菌及其多样性

金银花品系间的差异与其内生菌多样性密切相关，分离组织部位不同，种群、类型及数量也有所不同。目前已筛选并鉴定的金银花内生菌见表4，分为细菌和真菌，涉及14个属，但未见内生放线菌的相关报道。内生细菌均为芽孢杆菌属，内生真菌以镰孢属、链格孢属、木霉属居多。

金银花内生菌大多具有广谱抑菌活性，孙力军等人[29]从金银花组织中筛选出一株内生多粘类芽胞杆菌对藤黄微球菌、酒精酵母、香蕉炭疽病菌、青霉、黑曲霉、黄色镰刀霉、赤霉均具有抑制效果。李瑾等人[30]筛选出两株内生真菌对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌具有良好的抑菌效果。刘士平等人[31]筛选出两株抑菌效果较好的产黄酮类物质的金银花内生镰孢菌和拟盘多毛孢菌。Zhang等人[32]从中药植物金银花中筛选出一株内生镰刀菌，其代谢产物对绿脓杆菌有高效抑制作用。除抑菌效果外，金银花内生菌还具有特殊酶活性，杨胜远等人[33]筛选出一株具有谷氨酸脱羧酶活性的内生巨大芽孢杆菌。郭钦等人[34]筛选出一株链格孢属内生真菌，其代谢产物具有较高的抗单胺氧化酶活性。吕凤霞[35]从金银花等植株中筛选出具有纤溶酶活性多粘芽孢杆菌。金银花内生菌还可以产生其宿主活性成分，刘洋露等人[36]、邱萌霞等人[37]均筛选出产绿原酸的芽孢杆菌。

表4 金银花内生菌筛选现状

3 金银花内生菌的应用

3.1 生物防治

内生菌对病原菌的生物防治涉及抗菌、竞争关系、诱导免疫等多种机制，是对动植物病虫害防治的一种具有高效性、选择性、环保性等最具发展潜力的防治策略。

赵银丽等人[40]将筛选出的一株金银花内生真菌进行发酵并对给毒后的鲤鱼进行投喂，发现其可调节鲤鱼肠道菌群、增加有益菌、使致病性降低。Cui等人[41]筛选出一株贝莱斯芽孢杆菌，可诱导金银花叶片生成具有抑制病原菌物质合成的相关酶，减少植物白粉病的发生。曹鹏飞等人[42]从金银花等植物中筛选出一株木霉属真菌，发现其可破坏杨梅枯萎病病原菌细胞壁完整性、增加细胞膜通透性、使病原菌生长受到抑制或致其死亡。Kang等人[43]筛选出一株内生链霉菌，其产生的金霉素和别金霉素可抑制赤松线虫的生长繁殖从而起到保护植株的作用。有研究表明植物内生真菌和细菌可联合作用抑制病害生长，提高宿主植物免疫力，内生微生物的联合作用机制是未来植物健康管理的重要方向。

3.2 生物发酵合成绿原酸

金银花内生菌生物发酵应用集中于绿原酸的发酵生产，刘洋露等人[36]、邱萌霞等人[37]均筛选出可以产绿原酸的内生细菌，并进行发酵条件的优化，绿原酸产量最高可达24.02mg/L。此外，通过添加辅助因子与内生菌共同发酵，提高绿原酸的产量。丁仁芳等人[44]利用内生枯草芽孢杆菌和富含氨基酸、蛋白质及矿物元素的红薯叶粗提液共同发酵，其绿原酸产量每升增加55.22 mg。张枫源等人[45]利用内生枯草芽孢杆菌与金银花蒸馏残液共同发酵，优化工艺后，绿原酸每升可增产193mg。

3.3 生物催化合成酶

内生菌作为生物催化剂可增加生物过程的立体专一性，利用其代谢过程中产生的酶对外源化合物进行催化反应，可简化目标物质的纯化工艺。工程菌是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点，植物内生菌具有丰富的酶活性，可作为其宝贵的基因库。

王川等人[46]从金银花中分离出一株代谢产物可以产肉桂酸的内生枯草芽孢杆菌，具有产HAL(组氨酸解氨基酶)和PAL(苯丙氨酸解氨基酶)双功能，克隆HAL基因，催化反应成功产生肉桂酸。随后又对其细胞色素P450基因进行原核表达，重组蛋白具有肉桂酸羟基化酶活性，并成功催化底物产生了香豆酸[47]。吕凤霞[35]筛选出具有纤溶酶活性和体外溶栓效果的内生多粘芽孢杆菌，对其纤溶酶基因克隆与表达、纯化蛋白后活力可达2096IU/mg，并具有明显的体外溶栓能力，为植物内生菌来源溶栓药物的开发提供了新的途径。

3.4 促进植物生长

土壤环境对植物的生长具有重大影响，其微生物可与植物相互作用。极端环境条件下生长的植物往往具有较多特殊活性的有益内生菌[48]。刘方春等人[48]从金银花根部筛选出一株耐盐碱根际促生蜡样芽孢杆菌，可使金银花叶片中细胞分裂素增多，达到抗旱促生长的功效。土壤解磷菌可促进植物对磷的吸收利用，李剑峰等人[49]从石漠生境下金银花茎部筛选出一株高效解磷菌，促进了石漠化环境下植物的生长。Longfei等人[50]从药用植物金银花中筛选出六株可产生铁载体和吲哚乙酸的菌株，通过实验验证可促进小麦生长。Lucie等人[51]对忍冬植物内生菌促进植物生长的潜力进行分析，发现一株可以产生吲哚乙酸、氰化氢、铁载体，且具有大气固氮、溶解磷酸盐的内生菌，并可持续促进植物生长、提高植物次级代谢产物含量。

4 讨论

我国金银花种类丰富，其化学成分复杂。对金银花中绿原酸提取工作相关研究较为丰富，在纯度及提取液活性机理方面有待深入探究。木犀草苷作为重要的活性成分之一，首先其提取和分离工艺成本高，污染大，还存在较多困难；其次木犀草苷活性机理研究不充分，如木犀草苷已被证实具有缓解小鼠抑样行为，但对其活性机理并没有明确阐述。未来应更大限度的挖掘绿原酸和木犀草苷在动植物和人类健康发展方面应用潜力。

内生菌对植物宿主的相互作用包括调节宿主的合成代谢、与宿主的共享代谢或对宿主代谢成分的转化等方面。内生菌代谢产生丰富多样的活性物质，应用于产物发酵、植物生长、生物防治、生物催化等各个领域，在一定程度上可减少天然药材的消耗，为新药的开发提供新的途径，同时可促进农业的可持续发展。金银花资源丰富，但其内生菌筛选种类还有待加强，相关研究还处在菌株鉴定及发酵液活性研究上，对代谢产物的具体成分鉴定研究较少。直接利用内生菌生产目标产物，虽然成本低、易操作，但是产量较低，还应进一步筛选扩大资源范围、寻找高效菌株或对发酵工艺进行优化从而提高产量。此外，金银花内生菌相关作用机制尚不明确，其内生菌基因组学、转录组学研究可进一步揭示其相互调控机制，但难度较高，重复性差。